叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒微板法

叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒微板法

叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒说明书 （货号：WS2160W 微板法 96 样） 一、产品简介： 叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是卡尔文循环中的关键酶。催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反应产生 1,3-二磷酸甘油酸，后者在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘 油醛和 NAD+，通过测定 NADH 的下降量，进而得到 3-磷酸甘油酸激酶的活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×3 支 4℃保存 用前取一支甩几下或离心使试剂 落入底部，再加 0.4mL 蒸馏水溶解 备用。 试剂三 液体μL×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、震荡仪、低温离心机、研钵。 四、叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 植物组织样本，加入 1mL 提取液一，快速冰浴匀浆后于 4℃，1600rpm 离 心 5min，弃沉淀，取上清再 4℃，5000rpm 离心 15min，弃上清留沉淀，向沉淀中加 1mL 提取液二，强力涡旋震荡 15s，置于冰上(或冰箱)在 4℃孵育 15min，4℃，13000rpm 离心 5min，取上清测定叶绿体中 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的酶活性。提示：整个叶绿体的提取 过程须保持 4℃低温环境。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，设定温度 25℃。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10本试剂盒仅供科研使用 2 【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到 20min 后读取 A2，改变后的反应时间需代 入计算公式重新计算。或适当加大样本量(如 40μL，则试剂四相应减少)，则改变后的加 样体积需代入计算公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会 偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于 检测； 4. 若ΔA 的值大于 0.5，则需减少反应时间（如减少至 5min），或减少样本量（如 10μL）， 则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本质量计算 酶活定义：每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GPK（nmol/min/g 鲜重）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=321.6×ΔA÷W 2、按样本蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GPK（nmol/min/mg prot）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.6×ΔA÷Cpr ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L； T---反应时间，10min； W---样本质量，g。 试剂四 140 混匀，室温（25℃）条件下，孵育 10min 试剂五 10 轻轻混匀，室温（25℃）条件下，30s 时于 340nm 处读取吸光值 A1，10min 后再读取 A2， ΔA=A1-A2。