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肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法

更新时间:2024-06-20

简要描述:

肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法
肌酸激酶(CK,EC 2.7.3.2)主要存在于心脏、肌肉及脑等组织中,能可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应,在能量运转、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。

肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法

肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)活性测定说明书 (货号:WS2880W 微板法 96 样) 一、产品简介: 肌酸激酶(CKEC 2.7.3.2)主要存在于心脏、肌肉及脑等组织中,能可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应,在能量运转、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。 肌酸激酶(CK)催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸,后者很快全部水解为磷酸, 但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很稳定;通过定磷试剂来测定磷酸肌酸水解出 的磷酸含量检测 CK 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新枪头和玻璃移液器等,避免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、肌酸激酶(CK)活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 700nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。 ② 试剂一和二和三可按照 20:20:210 预先配成混合液(现配现用);在 EP 管中依次加入: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 120mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 4.2mL 蒸馏水溶解(可超声溶解)。 试剂二 粉体 mg×1 -20℃用前甩几下使试剂落入底部,再加 4.2mL 蒸馏水溶解(可超声溶解)。 试剂三 液体 44mL×1 4℃保存 试剂四 液体 9mL×1 4℃保存 试剂五 A:粉体 mg×2 B:液体 6.5mL×1 4℃保存 临用前在一瓶试剂 A 中加 3.24mL B 液,再加41.76mL蒸馏水混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 20 20 试剂二 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应,在 EP 管中直接加入: 【注】1.A 低于 0.01 可增加歩中样本加样体积 V1(如增至 100μL,则试剂三 相应减少,总反应体系不变),或延长 37℃ 孵育时间 T(如增至 60min); 或增加取样质量 W;则改变后的 V1 T W 需代入公式计算。 2.A 大于 1.2,可用蒸馏水对歩中上清液稀释,则稀释倍数 D 代入公式计算五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.4836x - 0.0025x 是标准品摩尔浓度(μmol/mL, y A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=28.12×(A+0.0025)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(W×V1÷V)÷T=28.12×(A+0.0025)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.056×(A+0.0025) 5、按液体体积计算: 定义:每小时每毫升液体产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷V1÷T=28.12×(A+0.0025) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.05mL W---样本鲜重,gV2---酶促反应总体积,0.34mLT---反应时间,1/2 小时; 500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(20μmol/mL):标准品用 1mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. μmol/mL。也可根据实际样本来调 整标准品浓度。 3 依据③歩中显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂三 210 210 样本 50 37℃ 孵育 30min 试剂四 40 40 样本 50 混匀,8000rpm4℃离心 5min,上清液待测。 上清液 100 100 试剂五 400 400 混匀,室温静置 10min,若浑浊则可 8000rpm4℃ 或室温离心 5min,取 250μL 澄清液体至 96 孔板中, 700nm 下读取各管吸光值,A=A 测定-A 对照(每 个样本做一个自身对照)。

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