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Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-20

简要描述:

Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法
Ca2+是细胞内重要的信号分子,细胞质基质始终维持在一个较低水平的 Ca2+浓度,Ca2+ 浓度的维持主要由 Ca2+-ATP 酶来维持

Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法

Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 Ca2+ - ATP 酶活性测定说明书 (货号:WS0680W 微板法 48 样) 一、产品简介: Ca2+是细胞内重要的信号分子,细胞质基质始终维持在一个较低水平的 Ca2+浓度,Ca2+ 浓度的维持主要由 Ca2+-ATP 酶来维持,该酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。通过 测定无机磷的量来确定该酶活性高低。 二、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 三、试剂盒的组成和配制: 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避 免磷污染。 四、Ca2+-ATP 酶活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4×12000rpm 离心 10min,取 上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 700nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 100 提取液 100 样本 100 试剂二 100 100 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 80mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 8mL 提取液,混匀溶解备用。 试剂二 粉体×1 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 15mL 提取液,混匀溶解备用。 试剂三 液体 4mL×1 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 B:液体 2mL×1 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 1.8mL B 液, 再加23.2mL的蒸馏水,混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 37℃ 孵育 20min 试剂三 40 40 样本 100 混匀,12000rpm4℃离心 5min,上清液待测 ③ 显色反应: 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.6402x - 0.0034x 是标准品摩尔质量(μmol/mL, y A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(A+0.0034)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T =15.93×(A+0.0034)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(A+0.0034) 5、液体中 Ca2+-ATPase 活力计算: 定义:每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(A+0.0034) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.1mL V2---酶促反应总体积,0.34mLT---反应时间,1/3 小时; W---样本鲜重,g500---细菌或细胞总数,万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整 标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 上清液 50 50 试剂四 200 200 混匀,室温静置 3min700nm 下读取各管吸光值, A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。

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