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Mg2+- ATP 酶试剂盒

更新时间:2024-06-20

简要描述:

Mg2+- ATP 酶试剂盒
Mg2+-ATP 酶与细胞维持胞内 Mg2+浓度有关, 可在运输 Mg2+的同时催化 ATP 水解生 成 ADP 和无机磷。通过测定无机磷的量可确定该酶活性高低。

Mg2+- ATP 酶试剂盒

Mg2+- ATP 酶试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 Mg2+ - ATP 酶活性测定说明书 (货号:WS0980F 分光法 24 样) 一、产品简介: Mg2+-ATP 酶与细胞维持胞内 Mg2+浓度有关, 可在运输 Mg2+的同时催化 ATP 水解生 ADP 和无机磷。通过测定无机磷的量可确定该酶活性高低。 二、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。 三、试剂盒的组成和配制: 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避 免磷污染。 四、Mg2+-ATP 酶活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min,取 上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)500~1000:1 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 700nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 EP 管中依次加入: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 18mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 9mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂三 液体 9mL×1 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 B:液体 1mL×1 4℃保存 临用前向 A 试剂中加 1.35mL B 液, 再加 17.4mL 的蒸馏水,混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg ×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 300 300 试剂二 300本试剂盒仅供科研使用 2 ④ 显色反应: 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 2.0283x - 0.0002x 是标准品摩尔质量(μmol/mL, y A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(V1×Cpr)÷T=5.18×(A+0.0002)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(W×V1÷V)÷T=5.18×(A+0.0002)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/104 cell)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.0104×(A+0.0002) 5、液体中 Mg2+-ATPase 活力计算: 定义:每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷V1÷T=5.18×(A+0.0002) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.3mL V2---酶促反应总体积,1.05mLT---反应时间,1/3 小时; W---样本鲜重,g500---细菌或细胞总数,500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.42, 0.5. μmol/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 蒸馏水 300 样本 300 300 37℃ 孵育 20min 试剂三 150 150 混匀,12000rpm4℃离心 5min,上清液待测 上清液 450 450 试剂四 300 300 混匀,室温静置 10min700nm 下读取各管吸光值, A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。

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