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线粒体H+- ATP酶试剂盒

更新时间:2024-06-20

简要描述:

线粒体H+- ATP酶试剂盒
线粒体是细胞呼吸代谢的重要场所,位于线粒体内膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶 联的关键组分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷

线粒体H+- ATP酶试剂盒

线粒体H+- ATP酶试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 线粒体 H+ - ATP 酶活性测定说明书 (货号:WS3680F 分光法 24 样) 一、产品简介: 线粒体是细胞呼吸代谢的重要场所,位于线粒体内膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶 联的关键组分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷,本试剂盒通过测定无 机磷的量来确定该酶活性高低。 二、试剂盒的组成和配制: 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避 免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。 四、线粒体 H+ -ATP 酶活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免 实验样本和试剂浪费! 1、线粒体制备(提示:整个线粒体的提取过程须保持 4低温环境): ① 称取约 0.2g 组织或收集 1000 万细菌/细胞,加入 1mL 提取液 1,用冰浴匀浆器或研 钵冰浴匀浆,转移至离心管后于 4×3000g 离心 20min② 小心吸取上清液(弃沉淀)移至另一离心管中,4×16000g 离心 20min。用移液器 移除上清液(上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 H+- ATP 酶(此步可选做))。留下沉淀(沉淀即为线粒体)。 ③ 在沉淀(线粒体)中加入 200μL 提取液 2,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W超声 5s,间隔 3s,重复 30 次),液体置于冰上用于线粒体 H+ - ATP 酶活性测定。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取,或按照 细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 740nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 1 提取液 30mL×1 4℃保存 提取液 2 提取液 7mL×1 4℃保存 试剂一 液体 14mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 2mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂三 液体 3mL×1 4℃保存 试剂四 粉剂×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 1.8mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂五 粉剂×1 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 0.7mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂六 液体 5mL×1 4℃保存 试剂七 A:粉体 mg×1 B:液体 2mL×1 4℃保存 临用前加 1.8 mL B 液,再加 23.2 mL 的蒸馏水,混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入: ④ 显色反应,在 EP 管中依次加入: 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 1.7406x - 0.0035x 是标准品摩尔质量(μmol/mL, y 是△A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(A+0.0035)÷1.7406×V2] ÷V1×Cpr÷T =13.36×(A+0.0035)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)= [(A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(W×V1÷V)÷T =13.36×(A+0.0035)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)= [(A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(500×V1÷V)÷T =0.027×(A+0.0035) 5、液体中酶活力计算: 定义:每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL= [(A+0.0035)÷1.7406×V2]÷V1÷T=13.36×(A+0.0035) 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 210 225 试剂二 30 30 试剂三 45 45 试剂四 30 30 样本 60 60 混匀,静置 5min 试剂五 15 混匀,37℃孵育 20min 试剂六 75 75 混匀,12000rpm4℃离心 5min,上清液待测 上清液 300 300 试剂七 450 450 混匀,室温静置 15min740nm 下读取各管吸光值, A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。本试剂盒仅供科研使用 3 V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.06mL V2---酶促反应总体积,0.465mLT---反应时间,1/3 小时; W---样本鲜重,g500---细菌或细胞总数,500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。

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