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丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒

更新时间:2024-06-20

简要描述:

丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒
丙酮酸脱氢酶(PDH,EC 1.2.4.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中

丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒

丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenasePDH)试剂盒说明书 (货号:WS6380F 分光法 48 样) 一、产品简介: 丙酮酸脱氢酶(PDHEC 1.2.4.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中, 是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,把糖酵解和三羧酸循环连 接起来。 丙酮酸脱氢酶(PDH)催化底物丙酮酸钠生成羟*基-TPP,在电子传递体(PMS存在下,使噻唑蓝(MTT)还原生成蓝色产物,通过检测该蓝色产物在 566nm 处的增 加速率,即可得出 PDH 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 50mL×1 -20℃保存 试剂二 液体 10mL×1 -20℃保存 试剂三 液体μL×1 -20℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 每支加 1.2mL 的蒸馏水溶解。 试剂五 粉剂 mg×4 4℃避光保存 用前甩几下使试剂落入底部, 每支加 0.6mL 的蒸馏水溶解。 一天内用完。 试剂六 粉剂 mg×2 4℃避光保存 用前甩几下使试剂落入底部, 每支加 1.2mL 的蒸馏水溶解。 一周内用完。 试剂七 液体 32mL×1 4℃保存 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。 四、丙酮酸脱氢酶(PDH)活性测定: 1、线粒体制备(提示:整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境)① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌/细胞,加入 1mL 试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀 浆,转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min② 弃沉淀,上清液移至另一离心管中,4℃×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的酶活性(此步可选做)),留下沉淀 (沉淀即为线粒体)。 ③ 在沉淀(线粒体)中加入200μL试剂二和2μL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),液体置于冰上用于丙酮酸脱氢酶活性测定。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取,或按照细 /细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 566nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=107.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=21.7×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活单位。 PDH 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.044×ΔA ε---还原型 MTT 的摩尔消光系数,1.865×104 L/mol/cmd---96 孔板光径,0.5cmV---加入提取液体积,0.202mLV1---加入样本体积,0.01 mLV2---反应体系总体积,2×10-4 LT---反应时间,20minW---样本质量,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 试剂名称(μL测定管 样本 40 试剂四 40 试剂五 40 试剂六 40 试剂七 640 混匀,30℃下,10s 时于 566nm 处读取吸光 A110min 后读取吸光值 A2A=A2-A1)测定管-A2-A1)对照管。

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