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NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-20

简要描述:

NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法
NADH 氧化酶(NOX,EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中, 可在氧气存在下,直接将 NADH 氧化为 NAD。

NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法

NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH 氧化酶(NADH oxidaseNOX)试剂盒说明书 (货号:WS3080W 微板法 96 样) 一、产品简介: NADH 氧化酶(NOXEC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中, 可在氧气存在下,直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生,而且与免疫 反应密切相关。 NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD,通过检测 NADH 340nm 处的下降速率,即可得 NADH 氧化酶活性的大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 -20℃保存 试剂二 液体 20mL×1 -20℃保存 试剂三 液体 16mL×1 4℃保存 试剂四 粉剂×1 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,再加 1.5mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 粉剂×3 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,每支再加 0.5mL 蒸馏水溶解 ,用不完的试剂分装后-20℃保存, 禁止反复冻融,三天内用完。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。 四、NADH 氧化酶(NOX)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、线粒体制备(提示:整个线粒体的提取过程须保持 4低温环境)① 称取约 0.2g 组织或收集 1000 万细菌/细胞,加入 1mL 试剂一,用冰浴匀浆器或研钵冰 浴匀浆,转移至离心管后于 4×3000g 离心 20min② 小心吸取上清液(弃沉淀)移至另一离心管中,4×16000g 离心 20min。用移液器移 除上清液(上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 NOX(此 步可选做))。留下沉淀(沉淀即为线粒体)。 ③ 在沉淀(线粒体)中加入 200μL 试剂二,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超 5s,间隔 3s,重复 30 次),液体置于冰上用于线粒体 NOX 酶活性测定。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取,或按照细 菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。 2、上机检测1 酶标仪预热 30min 以上,设定温度 25℃,调节波长至 340nm2 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 试剂三 160 试剂四 10 试剂五 10本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,室温(25℃)静置 3min 样本 20 混匀,室温(25℃)立即于 340nm 处读 A15min 后读取 A2,△A=A1-A2 【注】若△A 的值在零附近,可以延长反应时间 T(如至 10min 或更长),则改变后的 反应时间 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 NOXnmol/min /mg prot=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 NOXnmol/min /g 鲜重)=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(W× V1÷V)÷T=128.6×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NOXnmol/min /104 cell=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmd---96 孔板光径,0.5cmV--- 加 入 提 取 液 体 积 , 0.2mL V1--- 加 入 样 本 体 积 , 0.02mL V2---反应体系总体积,2×10-4 LT---反应时间,5minW---样本质量,g500---细胞或细菌总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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