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叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒

更新时间:2024-06-17

简要描述:

叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒
叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是卡尔文循环中的关键酶,催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反应产生 1,3-二磷酸甘油酸

叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)试剂盒说明书 (货号:WS2160F 分光法 48 样) 一、产品简介: 叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是卡尔文循环中的关键酶,催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反应产生 1,3-二磷酸甘油酸,后者在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘 油醛和 NAD+,通过测定 NADH 的下降量,进而得到 3-磷酸甘油酸激酶的活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 50mL×1 4℃保存 提取液二 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×3 4℃保存 用前取一支甩几下或离心使试剂 落入底部,再加 0.4mL 蒸馏水溶解 备用。 试剂三 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 35mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、天平、震荡仪、低 温离心机、研钵。 三、叶绿体 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 称取约 0.1g 植物组织样本,加入 1mL 提取液一,快速冰浴匀浆后于 4℃,1600rpm 5min,弃沉淀,取上清再 4℃,5000rpm 离心 15min,弃上清留沉淀,向沉淀中加 1mL 提取液二,强力涡旋震荡 15s,置于冰上(或冰箱)4℃孵育 15min4℃,13000rpm 离心 5min,取上清测定叶绿体中 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的酶活性。提示:整个叶绿体的提取 过程须保持 4低温环境。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 紫外分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,设定温度 25℃,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 80 试剂一 40 试剂二 20 试剂三 20 试剂四 600 混匀,室温(25℃)条件下,孵育 10min 试剂五 20 轻轻混匀,室温(25℃)条件下,30s 时于 340nm 处读取吸光值 A110min 后再读取 A2ΔA=A1-A2【注】1.A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 20min 后读取 A2,改变后的反应时间 需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(100μL,则试剂四相应减少),则改变 后的加样体积需代入计算公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定,可以每隔 20S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与 计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会 偏高),可以适当减少样本加样量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 12000rpm, 4离心 10min,上清液用于 检测; 4. ΔA 的值大于 0.5,则需减少反应时间(如减少至 5min),或减少样本量(如 20μL), 则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按照样本质量计算 酶活定义:每克组织每分消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GPKnmol/min/g 鲜重)= [ ΔA÷ε×d×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=156.8×ΔA÷W 2、按样本蛋白浓度计算 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GPKnmol/min/mg prot= [ ΔA÷ε×d×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=156.8×ΔA÷Cpr ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd---比色皿光径,1cmV---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.08mLV2---反应体系总体积,0.78mL=7.8×10-4LT---反应时间,10minW---样本质量,g

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