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丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒微板法

更新时间:2024-06-17

简要描述:

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒微板法
丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK,EC 2.7.9.1)是C 4途径和景 天科植物的一个重要限速酶,催化CO 2的原初受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的形成

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒微板法

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 丙酮酸磷酸双激酶( PPDK)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS1160W 微板法 96 样) 一、产品简介: 丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinasePPDKEC 2.7.9.1)C 4途径和景 天科植物的一个重要限速酶,催化CO 2的原初受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的形成,对植 物光合作用具有重要调节作用。 丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)逆向催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMPPpi生成丙酮酸、ATP Pi。偶联乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。因此通过检测340nm NADH的下降速率,即可得出PPDK的酶活性大小。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部, 再分别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 试剂三 粉剂 mg×3 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部, 每支分别加 0.44mL 蒸馏水溶解备用。 用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止 反复冻融,三天内用完。 试剂四 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部, 再加 2.2mL 蒸馏水溶解(可超声加速 溶解),备用。 试剂五 液体 15mL×1 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部, 再分别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。 四、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 称取约 0.1g 组织样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂四 20 试剂五 130 试剂六 10 混匀,室温(25℃)条件下,立即于 340nm 处读取 A15min 后读取 A2。△A=A1-A2【注】 1.若△A 在零附近,可适当延长反应时间 T(如增至 10min 或更长读取 A2)。或适当加大样 本量 V1(如增至 20μL,则试剂五相应减少),则改变后的 T V1 需代入公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高),可减少样本加样 V1(如减至 5μL,则试剂五相应增加),则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 12000rpm, 4℃离心 10min,上清液用于检测; 3. ΔA 的值大于 0.5,则需减少反应时间 T(如减少至 1min),则改变后的反应时间 T 需代 入计算公式重新计算。 4. 若下降趋势不稳定,可以每隔 20S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与 计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PPDK 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =1286.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PPDK 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T =1286.2×ΔA÷W V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.01mLV2---反应体系总体积,2×10-4 Ld---96 孔板光径,0.5cmε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmW---样本质量,gT---反应时间,5minCpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。

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