丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）试剂盒微板法

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）试剂盒微板法

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 丙酮酸磷酸双激酶( PPDK)活性测定试剂盒说明书 （货号：WS1160W 微板法 96 样） 一、产品简介： 丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK，EC 2.7.9.1)是C 4途径和景 天科植物的一个重要限速酶，催化CO 2的原初受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的形成，对植 物光合作用具有重要调节作用。 丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)逆向催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和 Ppi生成丙酮酸、ATP 和Pi。偶联乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。因此通过检测340nm 处NADH的下降速率，即可得出PPDK的酶活性大小。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再分别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 试剂三 粉剂 mg×3 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 每支分别加 0.44mL 蒸馏水溶解备用。 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。 试剂四 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再加 2.2mL 蒸馏水溶解（可超声加速 溶解），备用。 试剂五 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再分别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。 四、丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂四 20 试剂五 130 试剂六 10 混匀，室温（25℃）条件下，立即于 340nm 处读取 A1，5min 后读取 A2。△A=A1-A2。 【注】 1.若△A 在零附近，可适当延长反应时间 T（如增至 10min 或更长读取 A2）。或适当加大样 本量 V1（如增至 20μL，则试剂五相应减少），则改变后的 T 或 V1 需代入公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高），可减少样本加样 量 V1（如减至 5μL，则试剂五相应增加），则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测； 3. 若ΔA 的值大于 0.5，则需减少反应时间 T（如减少至 1min），则改变后的反应时间 T 需代 入计算公式重新计算。 4. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PPDK 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =1286.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PPDK 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T =1286.2×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，5min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。