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芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-12

简要描述:

芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法
芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3),广泛存在于动物、植物、微生物中,可水 解带有酰胺基团的化合物

芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法

芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 芳基酰胺酶活性测定试剂盒说明书 (货号:WS3340W 微板法 96 样) 一、产品简介: 芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3),广泛存在于动物、植物、微生物中,可水 解带有酰胺基团的化合物,是生物体内农药及其他外源物质的重要水解酶之一。 本试剂盒采用芳基酰胺酶水解底物产生对硝基苯胺,在波长 405nm 处有最大吸收峰, 通过检测生成的产物对硝基苯胺在 405nm 处的增长速率即可得出该酶活性大小。 二、测试盒组成和配制: 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、离心机、可调式移液器、研钵、乙醇、冰和蒸馏水。 四、芳基酰胺酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂 一,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 15min,取 上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 405nm② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 为了减少操作误差,建议使用排枪。 ④ 依次在 96 孔板中加入: 【注】1. 加完试剂二即启动反应,所以试剂二加完混匀后立即检测,若 A2 值大于 1.5,可对样本进行稀 释,稀释倍数需代入公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 125mL×1 4℃保存 试剂二 液体 4mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若要重新做标曲则用到该试剂。 试剂名称(μL测定管 试剂一 120 样本 40 试剂二 40 混匀,立即405nm 处读取 A1 值,37℃反应 30min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1本试剂盒仅供科研使用 2 2. ΔA小于0.005,可增大样本量V1(如增至80μL,试剂一相应减少),则改变后的V1需代入公 式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0279x - 0.009x 为标准品(nmoL)y ΔA2、按样本鲜重计算: 单位定义:在 37℃,每克组织每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。 芳基酰胺酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(W×V1÷V)÷T =29.87×(ΔA+0.009)÷W 3、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:在37℃,每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmoL标准品定义为一个酶活单位(U)。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mg prot)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(V1×Cpr)÷T=29.87×(ΔA+0.009)÷Cpr 4、按细胞数量计算: 酶活定义:在 37℃,每 104个细胞每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。 芳基酰胺酶(nmoL/min/104 cell)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(500×V1÷V)÷T=0.06×(ΔA+0.009) 5、按照液体体积计算: 单位定义:在 37℃,每毫升液体每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷V1÷T=29.87×(ΔA+0.009) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.04mLT---反应时间,30minW---样本质量,g500---细胞数量; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):临用前甩几下或离心,使粉体落入底部,加入 0.1mL 乙醇,涡旋震荡溶解后再加入 0.9mL 的蒸馏水混匀,得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际来 调整浓度。 3 40μL 标准品+160μL 试剂一,混匀后于 405nm 处读取 A 值,依据结果即可制作标准 曲线。

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