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乙酰乳酸合成酶(ALS)活性试剂盒

更新时间:2024-06-12

简要描述:

乙酰乳酸合成酶(ALS)活性试剂盒
乙酰乳酸合成酶( ALS,EC 2.2.1.6) 是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶

乙酰乳酸合成酶(ALS)活性试剂盒

乙酰乳酸合成酶(ALS)活性试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase, ALS)活性测定试剂盒 (货号:WS2440F 分光法 24 样) 一、产品简介: 乙酰乳酸合成酶( ALSEC 2.2.1.6) 是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶,此生 物合成过程只存在于植物和微生物体内,是绿色除草剂的重要作用靶标。 乙酰乳酸合成酶( ALS)可催化 2 分子的丙酮酸生成乙酰乳酸,该产物在硫酸作用下脱羧 生成乙酰甲基甲醇,该产物与显色剂反应生成有色物质,该有色物质在 525nm 处有特征 吸收峰,通过检测该有色物质的增加速率即可得出 ALS 酶活性大小。 反应方程式:2 pyruvate =2-acetolactate+CO2二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底 部,再加 1.2mL 蒸馏水混匀 溶解,仍 4℃保存。 试剂二 液体 15mL×1 4℃保存 试剂三 液体 2mL×1 4℃保存 试剂四 液体 10mL×1 4℃保存 试剂五 液体 10mL×1 4℃保存 标准品 粉体×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液 器、研钵、蒸馏水。 四、乙酰乳酸合成酶(ALS)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰 浴匀浆,4×12000rpm 离心 15min,取上清液待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30 min,调节波长为 525nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂于 25℃水浴中预热 10 min③ 在 EP 管中依次加入下列试剂: 试剂名称(μL样本管 对照管 试剂一 40本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 260 300 样本 100 100 35℃条件下,暗反应 1h 试剂三 40 40 60℃条件下水浴脱羧 15min 试剂四 200 200 试剂五 200 200 60℃下水浴显色 15min12000rpm 离心 5min,取澄清 上清液至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm),于 525nm 读值。ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。 【注】:若ΔA 的值非常低在零附近,可增加样本量 V1(如增至 200μL,则试剂二相应减少) 或延长反应时间 T(如增至 2h 或更长),则重新调整的 V1 T 代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0156x + 0.0023x 是标准品乙酰甲基甲醇摩尔质量(nmol);y 是△A2按照样本质量计算: 酶活定义:每克组织每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/g 鲜重)=[(A-0.0023)÷0.0156]÷(W×V1÷V)÷T×D=641×(A-0.0023)÷W×D 3按照样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克蛋白每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/mg prot)=[(A-0.0023)÷0.0156]÷(Cpr×V1)÷T×D =641×(A-0.0023)÷Cpr×D 4、按细菌数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/104 cell)=[(A-0.0023)÷0.0156]÷(500×V1÷V)÷T×D=1.28×(ΔA-0.0023)×D W---样品质量,gV---提取液体积,1 mLV1---上清液体积(mL),0.1mLT---反应时间,1hD---稀释倍数,未稀释即为 1500---细胞数量,万; Cpr---上清液蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水混匀溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:00.010.020.030.040.05 mg/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线,标准品乙酰甲基甲醇的摩 尔质量为 88.11

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