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NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

更新时间:2024-06-04

简要描述:

NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法
谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADH 或 NADPH,在动植物种两种辅酶都有存在,而以 NADH-谷*酸脱 氢酶(EC 1.4.1.2)活力为主。

NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH-谷*酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒说明书 (货号:WS5040W 微板法 96 样) 一、产品简介: 谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADH NADPH,在动植物种两种辅酶都有存在,而以 NADH-谷*酸脱 氢酶(EC 1.4.1.2)活力为主。 本试剂盒提供一种快速灵敏的检测方法,样品中的 NADH-谷*酸脱氢酶特异性作用于底 物谷*酸并产生 NADH,同时与显色剂反应生成黄色物质,该物质在 450nm 处有最大吸收 峰,进而得到 NADH-GDH 的酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、NADH-谷*酸脱氢酶(NADH-GDH)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液;超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进 行提取 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm② 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 4℃保存 浓度为 1M 试剂二 液体 2mL×1 4℃保存 试剂三 液体 1mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 试剂名称(μL测定管 提取液 80 试剂一 50 试剂二 20 样本 40 试剂三 10 混匀,立即 450nm 下读取 A1 值,15min本试剂盒仅供科研使用 2 【注】:若ΔA 值过小,可以延长反应时间 T(如由 15min 增至 30min 1 小时), 或增加加样体积 V1(如由 40μL 增至 80μL,则提取液相应减少),则改变 后的 T V1 需要代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线的方程:y = 0.0614x - 0.0064x NADH 摩尔质量(nmol),y ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(V1×Cpr) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(W×V1÷V) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷W 4、按细菌/细胞密度计算: 单位定义:每 1 万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(500×V1÷V) ÷T =0.0543×(ΔA+0.0064) 5、按液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷V1÷T=27.14×(ΔA+0.0064) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.04 mLT---反应时间,15minW---样本质量,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2. nmol /μL。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。 后读取 A2 值。ΔA=A 2-A1

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