NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH-谷*酸脱氢酶（NADH-GDH）试剂盒说明书 （货号：WS5040W 微板法 96 样） 一、产品简介： 谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADH 或 NADPH，在动植物种两种辅酶都有存在，而以 NADH-谷*酸脱 氢酶（EC 1.4.1.2）活力为主。 本试剂盒提供一种快速灵敏的检测方法，样品中的 NADH-谷*酸脱氢酶特异性作用于底 物谷*酸并产生 NADH，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在 450nm 处有最大吸收 峰，进而得到 NADH-GDH 的酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、NADH-谷*酸脱氢酶（NADH-GDH）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进 行提取 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 浓度为 1M 试剂二 液体 2mL×1 支 4℃保存 试剂三 液体 1mL×1 支 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 试剂名称（μL） 测定管 提取液 80 试剂一 50 试剂二 20 样本 40 试剂三 10 混匀，立即 450nm 下读取 A1 值，15min本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：若ΔA 值过小，可以延长反应时间 T（如由 15min 增至 30min 或 1 小时）， 或增加加样体积 V1（如由 40μL 增至 80μL，则提取液相应减少），则改变 后的 T 和 V1 需要代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线的方程：y = 0.0614x - 0.0064，x 是 NADH 摩尔质量（nmol），y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(V1×Cpr) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(W×V1÷V) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷W 4、按细菌/细胞密度计算： 单位定义：每 1 万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(500×V1÷V) ÷T =0.0543×(ΔA+0.0064) 5、按液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷V1÷T=27.14×(ΔA+0.0064) V---加入提取液体积，1 mL；V1---加入样本体积，0.04 mL； T---反应时间，15min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸馏水（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2. nmol /μL。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。 后读取 A2 值。ΔA=A 2-A1。