更新时间:2024-06-04
NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADH 或 NADPH,在动植物种两种辅酶都有存在,而以 NADH-谷*酸脱氢 酶(EC 1.4.1.2)活力为主。
NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒
NADH-谷an酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 1 NADH-谷*酸脱氢酶(NADH-GDH)试剂盒说明书 (货号:WS5040F 分光法 48 样) 一、产品简介: 谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADH 或 NADPH,在动植物种两种辅酶都有存在,而以 NADH-谷*酸脱氢 酶(EC 1.4.1.2)活力为主。 本试剂盒提供一种快速灵敏的检测方法,样品中的 NADH-谷*酸脱氢酶特异性作用于底 物谷*酸并产生 NADH,同时与显色剂反应生成黄色物质,该物质在 450nm 处有最大吸收 峰,进而得到 NADH-GDH 的酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体70mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体10mL×1瓶 4℃保存 浓度为1M 试剂二 液体5mL×1瓶 4℃保存 试剂三 液体2.2mL×1支 4℃保存 标准品 粉剂mg×1支 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 注:粉剂量在 mg 级别,使用前用手甩几次或者进行离心,打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水。 四、NADH-谷*酸脱氢酶(NADH-GDH)活性测定: 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min,取上清 液,置冰上待测。(或按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取) ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。(或按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL) 为 500~1000:1 的比例进行提取) ③ 液体样本:直接检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。 ② 在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入: 试剂名称(μL) 测定管 提取液 320 试剂一 200 试剂二 80 样本 160 试剂三 40 混匀,立即 450nm 下读取 A1 值,15min 后读取 A2 值。ΔA=A 2-A1。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】:若ΔA 值过小,可以延长反应时间 T(如由 15min 增至 30min 或 1 小时), 或增加加样体积 V1(如由 160μL 增至 320μL,则提取液相应减少),则改 变后的 T 和 V1 需要代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线的方程:y =0.0338x - 0.0434,x 是 NADH 摩尔质量(nmol),y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(V1×Cpr)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(W×V1÷V)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷W 4、按细菌/细胞密度计算: 单位定义:每 1 万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(500×V1÷V) ÷T =0.025×(ΔA+0.0434) 5、液体中 NADH-GDH 活力的计算: 单位定义:每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷V1÷T=12.33×(ΔA+0.0434) V---加入提取液体积,1 mL;V1---加入样本体积,0.16mL; T---反应时间,15 min; W---样本质量,g; 500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(0.5nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸馏水(母液需在 两天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2.nmol/μL。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。