NADPH-谷an酸脱氢酶(NADPH-GDH)试剂盒

NADPH-谷an酸脱氢酶(NADPH-GDH)试剂盒

NADPH-谷an酸脱氢酶(NADPH-GDH)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 NADPH-谷*酸脱氢酶（NADPH-GDH）试剂盒说明书 （货号：WS6040F 分光法 48 样） 一、产品简介： 谷*酸脱氢酶广泛分布于生物体中，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作 用。其辅酶是 NADPH 或 NADH，在动植物种两种辅酶都有存在，在酵母中主要是 NADPH -谷*酸脱氢酶（EC 1.4.1.4）。 本试剂盒提供一种快速灵敏的检测方法，样品中的 NADPH-谷*酸脱氢酶特异性作用于 底物谷*酸并产生 NADPH，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在 450nm 处有最大吸 收峰，进而得到 NADPH-GDH 的酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体70mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体10mL×1瓶 4℃保存 浓度为1M 试剂二 液体5mL×1瓶 4℃保存 试剂三 液体2.2mL×1支 4℃保存 标准品 粉剂mg×1支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 注：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水。 四、NADPH-谷*酸脱氢酶（NADPH-GDH）活性测定： 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min，取上 清，置冰上待测。（或按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取） ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。（或按照细菌或细胞数量（104 个）： 提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取） ③ 液体样本：直接检测。 2、上机检测： ①可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。 ② 在 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 提取液 320 试剂一 200 试剂二 80 样本 160 试剂三 40 混匀，立即 450nm 下读取 A1 值，15min 后读取 A2 值。ΔA=A 2-A1。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：若ΔA 值过小，可以延长反应时间 T（如由 15min 增至 30min 或 1 小时）， 或增加加样体积 V1（如由 160μL 增至 320μL，则提取液相应减少），则改 变后的 T 和 V1 需要代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线的方程：y = 0.0304x + 0.008，x 是 NADPH 摩尔质量（nmol），y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.008)÷0.0304]÷(V1×Cpr) ÷T =13.71×(ΔA-0.008)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟生成 1 nmolNADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.008)÷0.0304]÷(W×V1÷V) ÷T =13.71×(ΔA-0.008)÷W 4、按细菌/细胞密度计算： 单位定义：每 1 万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GDH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.008)÷0.0304]÷(500×V1÷V) ÷T =0.028×(ΔA-0.008) 5、液体中 NADPH-GDH 活力计算： 单位定义：每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.008)÷0.0304]÷V1÷T=13.71×(ΔA-0.008) V---加入提取液体积，1 mL；V1---加入样本体积，0.16mL； T---反应时间，15min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（0.5nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 1.2ml 蒸馏水（母液需在 两天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5.nmol/μL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。