磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性试剂盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性试剂盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 磷脂酸磷酸酯酶（Phosphatidate phosphatase）活性测定试剂盒 （货号：WS2290W 微板法 96 样） 一、产品简介： 磷脂酸磷酸酯酶也称为磷酸化酶磷酸酯酶（EC 3.1.3.17，PPase）是磷酸酯酶中的一种， 在脂类合成的信号传递中发挥着重要作用，其活性对含油量的提高具有重要意义，可作为 育种选择高含油量品种的生化指标。 本试剂盒利用磷脂酸磷酸酯酶（PPase）催化β-甘油磷酸分解产生无机磷分子，通过定 磷试剂测定无机磷增加速率，即可得出磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 【注】:全程需无磷环境；试剂配置最好用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器、研钵、冰。 四、磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离 心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 700nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。 ② 依次在 EP 管孔板中加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 200 200 试剂二 50 50 样本 50 35℃ 孵育 30min 试剂三 100 100 样本 50 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测 ③ 显色反应，在 96 板中加入： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉末全部落入底部， 加入 11mL 蒸馏水混匀溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 4mL×1 瓶 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 3.6mL 的 B 液， 再加 46.4mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 上清液 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近，可增加样本加样体积 V1（如增至 100μL，则试剂一相应减少）， 或延长反应时间 T（如增至 1 小时），则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y=0.6161x - 0.0038，x 是标准品浓度（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =26×(△A+0.0038)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷(W×V1÷V)÷T =26×(△A+0.0038)÷W 4、液体中 PPase 活力计算: 定义：每小时每毫升液体催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷V1÷T=26×(△A+0.0038) V---提取液体积，1mL； V1---样本体积，0.05mL ； V2---酶促反应总体积，0.4mL； T---反应时间，1/2 小时； W---样本鲜重，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1. 制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用 1mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2. 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂四 200 200 混匀，室温静置 3min，700nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。