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中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-19

简要描述:

中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法
木聚糖酶在自然界分布广泛,可从动物、植物和微生物中获得。

中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法

中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 中性木聚糖酶(Neutral XylanaseNEX)测定试剂盒说明书 (货号:WS0170W 微板法 96 样) 一、产品简介: 木聚糖酶在自然界分布广泛,可从动物、植物和微生物中获得。可将木聚糖降解成低 聚糖和木糖的一组酶的总称,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,广泛应用于酿造和饲料 工业中。 中性木聚糖酶(NEX)在中性环境中水解木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,在沸水 浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨中发生显色反应,在 540nm 处有特征吸收峰,反应 液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在 540nm 吸光值增加速 率,可计算 NEX 活力。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 100mL 液体×1 4℃保存 试剂一 25mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 12.5mL 试剂一溶解备用。 试剂三 21mL×1 -20℃保存 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、中性木聚糖酶(NEX)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: 1 组织样本:称取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 经预冷的 95%醇冰浴匀浆,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中 加入经预冷的 80%乙醇混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清, 留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液,涡旋混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104):提取液体积(mL)5001 的比例进行提取。 3 液体样本:澄清液体直接检测;若浑浊则 12000rpm4℃,离心 15min,取上清待测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min,调节波长至 540nm。在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 50 50 试剂二 50 40℃孵育60min 试剂二 50 试剂三 100 100本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,沸水浴(95-100℃5min,冷却至室温 蒸馏水 100 100 混匀,取出200μL待检液至96孔板中,于540nm处读取吸 光值AΔA=A测定-A对照(每个测定管设一个对照管)。 【注】1. A 值大于 1.5,最后一步检测时可进行稀释:如取 100μL 待检液至 96 孔板中,再加 100μL 蒸馏水,相当于稀释倍数 D 2,需带入计算公式参与计算。 2. ΔA 小于 0.01,则可增加样本加样体积 V1(如增至 100μL,则试剂一减少为 0μL), 则改变后的 V1 代入公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 2.3432x - 0.0246x 是标准品摩尔质量(μmol),y A2、按蛋白浓度计算: 酶活定义:40℃PH6.0 条件下,每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生 1nmol 木糖所需的 酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷Cpr×D 3、按鲜重计算: 酶活定义:40℃PH6.0 条件下,每克样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的 酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(W×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷W×D 4、按细菌/细胞密度计算: 酶活定义:40℃PH6.0 条件下,每 1 万个细菌或细胞每分钟分解木聚糖产生 1nmol 原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(500×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷500×D 5、按液体体积计算: 酶活定义:40℃PH6.0 条件下,每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 木糖 所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷V1÷T×D=142.3×(ΔA+0.0246)×D V--提取液体积,1mLV1--样本体积,0.05mLT--反应时间,60minW--样本质量,g; 木糖分子量--150.131500--细胞数量,万;D--稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4,0.6,0.8, 1. mg/mL3 50μL 标准品+50μL 试剂一+50μL 蒸馏水+100μL 试剂三,混匀,沸水浴(95-100℃5min,冷却至室温,再加 100μL 蒸馏水,混匀后取出 200μL 液体至 96 孔板中,于 540nm 处读取吸光值 A。根据结果即可制作标准曲线。

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