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多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

更新时间:2024-06-18

简要描述:

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法
果胶酶是指分解果胶的多种酶,主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶裂解酶(PL),果胶 甲酯酶(PME)和原果胶酶,贮藏过程中起作用的主要是 PG。

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonasePG)试剂盒说明书 (货号:WS1070W 微板法 96 样) 一、产品简介: 果胶酶是指分解果胶的多种酶,主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶裂解酶(PL),果胶 甲酯酶(PME)和原果胶酶,贮藏过程中起作用的主要是 PG。所以该酶在食品贮藏保鲜和 植物抗病性等领域具有较高的研究价值。 果胶在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下,能水解产生带有具有还原性醛基的半乳糖醛酸。 DNS 试剂反应生成红棕色物质,在 540nm 有特征吸收峰,测定 540nm 处吸光值变化 可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 4℃保存 试剂一 液体 14mL×1 4℃保存 试剂二 液体 14mL×1 4℃保存 试剂三 液体 30mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、天平、可调式移液器、恒温水浴锅、研钵、冰。 四、多聚半乳糖醛酸酶(PG)的测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴匀 浆,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经预 冷的 80%乙醇混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀。再 向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液,涡旋混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s间隔 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 5001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 130 试剂二 130 40℃水浴 30min本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近徘徊,可增加样本上样量 V1(如增加至 50μL,则试剂一或二相应减少), 或延长反应时间 T(如增至 1h),则改变后的 V1 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 18.053x - 0.0263x 为标准品质量,mgy 为△A2、按照蛋白浓度计算: 酶活定义:在 40℃,每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位。 PG 活性(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1×Cpr)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷Cpr 3、按照样本质量计算: 酶活定义:在 40℃,每克样本每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。 PG 活性(mg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×W)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷W 4、按细菌/细胞密度计算: 酶活定义:在 40℃,每 1 万个细菌或细胞每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶 活力单位(U)。 PG 活性(mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×500)÷T=0.011×(ΔA+0.0263) 5、按液体体积计算: 酶活定义:在 40℃,每毫升液体每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位 PG 活性(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷V1÷T=5.54×(ΔA+0.0263) V---加入提取液体积,1mLV1---反应中样本体积,0.02mLW---样本质量,gT---反应时间,0.5h; 500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 的蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成五个浓度梯度的标准品:012345.mg/mL。也可根据实际样 本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂三 150 150 沸水浴95-100℃)5min,冰浴或淋浴冷却后,取 200μL 96 孔板中,540nm 处测定吸光值 A,△A=A 测定管-A 对照管(每个测定管设一个对照管)。

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