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磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-14

简要描述:

磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)试剂盒,微板法
磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在碳水化合物代谢中起关键作用,并广泛存在于所有生物 体中。PGM 可使葡萄糖-1-磷酸(G1P)和葡萄糖-6-磷酸(G6P)互变

磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)试剂盒,微板法

磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 磷酸葡萄糖变位酶(PGM)试剂盒说明书 (货号:WS3650W 微板法 96 样) 一、产品简介: 磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在碳水化合物代谢中起关键作用,并广泛存在于所有生物 体中。PGM 可使葡萄糖-1-磷酸(G1P)和葡萄糖-6-磷酸(G6P)互变。当糖原分解时,PGM G1P 转化为 G6P,接着进入糖酵解途径产生 ATP,也可通过戊糖磷酸途径产生核糖和 NADPH。相反,当细胞需要能量时,PGM G6P 转化为 G1P,进而产生糖原。PGM 缺乏可导致与葡萄糖存储相关的疾病。 本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:PGM 将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖 -6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化形成 NADPH,接着与特异显色剂反应 生成有色物质,通过检测该有色物在 450nm 的增加速率,进而计算出 PGM 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂三 液体 1mL×1 4℃保存 试剂四 液体 15mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 标准品 粉剂 mg×1 -20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰。 四、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细胞样本: 先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破 碎细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,设置温度 37℃,调节波长至 450nm② 试剂放在 37℃水浴 5min③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 10 试剂一 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 150 混匀,37℃条件下孵育 10min 试剂五 10 混匀,37℃条件下,1min 时于 450nm 处读取 吸光值 A111min 时读取 A2,△A=A2-A1【注】:1. ΔA 过小,可以延长反应时间 T(如:21min 或更长)再读取 A2,或增加样本量 V1(如 增至 20μL,则试剂四相应减小),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 2. A2 值大于 1.5,可缩减反应时间 T(如:6min 或更短)再读取 A2,或减少样本量 V1 (如减至 5μL,则试剂四相应增加),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0838x - 0.0173x 是标准品摩尔质量:nmoly ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 PGMnmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷ (V1×Cpr) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 PGMnmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(W×V1÷V) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷W 4、按细胞数量计算: 单位定义:104个细胞每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活单位。 PGMnmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(500×V1÷V)÷T=0.24×(A+0.0173) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.01 mLW---样本质量,gT---反应时间,10 minCpr----样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. 0nmol/μL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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