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结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法

更新时间:2024-06-13

简要描述:

结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法
结合态淀粉合成酶 GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责 直链淀粉的合成。

结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法

结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 结合态淀粉合成酶(Granule-bound starch synthaseGBSS)试剂盒 (货号:WS8350W 微板法 96 样) 一、产品简介: 结合态淀粉合成酶 GBSSEC 2.4.1.21以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责 直链淀粉的合成。GBSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生 ADP,通过反应体系中添加的酶促混合物依次催化 NADP+还原为 NADPH,且 NADPH 生成量与前一 步反应中 ADP 生成量呈正比。 传统方法是通过检测 340nm NADPH 增加量,但该法检测灵敏度低,且易受到色素(如绿色叶片) 干扰,本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:该酶促过程产生的 NADPH 与特异的显色探针反 应生成有色物质,通过在 450nm 下检测该有色物质的增加速率,进而计算出 GBSS 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×2 4℃保存 试剂一 液体 60mL×1 4℃保存 试剂二 液体 6.5 mL×1 4℃保存 呈分散状态,用前务必摇匀,即可使用。 试剂三 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部,再加 1.1 mL 的蒸馏水溶解备用。 试剂四 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部,再加 6.5 mL 的试剂一溶解备用。 试剂五 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部,再加 17.5 mL 的试剂一溶解备用。 试剂六 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部,再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂七 液体 2.2mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 -20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、结合态淀粉合成酶(GBSS)活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1样本制备: 称取约 0.1g 组织(水分多的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 12000rpm4℃离心 10min,弃上清,在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,设定温度 25℃,调节波长至 450nm② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本(悬浮液) 40 40 试剂一 140 150 试剂二(用前务必摇匀) 30 30 试剂三 10 试剂四 30 30 混匀,30℃反应 20min,沸水浴(95-100℃)2min12000rpm本试剂盒仅供科研使用 1 4℃离心 10min,上清液待测。 ③ 显色反应,在 96 孔板中依次加入: 【注】:1.ΔA 过小,可加大样本量 V1(如:增至 80μL,则试剂一相应减少,反应总体积不变); 或延长步中 30℃的反应时间 T(如:延至 30min 或更长);或增加样本取样质量 W;则 调整后的 V1 T W 需代入计算公式重新计算。 2. A 测定大于 1,则可在步中对上清液用蒸馏水进行稀释,稀释倍数 D 代入公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.1132x + 0.0032x NADPH 摩尔质量:nmoly ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GBSS (nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(Cpr×V1) ÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷Cpr×D 3、按照样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GBSS(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(W×V1÷V)÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷W×D V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.04mLV2---上清液体积,100μLV3---反应体系总体积,250μLT---反应时间,20minW---样本质量; D---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 10μL 的标准品+180μL 蒸馏水+10μL 试剂七,混匀 10min 后,于 450nm 处读取吸光 值,根据结果即可制作标准曲线。 上清液 100 100 试剂五 80 80 试剂六 10 10 试剂七 10 10 混匀,室温(25℃)孵育 15min,立即于 450nm 处读取吸光 值。A=A 测定-A 对照(每个样本需做一个样本自身对照)。

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