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多糖含量测定试剂盒(ben酚-硫酸)微板法

更新时间:2024-06-13

简要描述:

多糖含量测定试剂盒(ben酚-硫酸)微板法
水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与*酚缩合成橙 黄色化合物,且颜色稳定

多糖含量测定试剂盒(ben酚-硫酸)微板法

多糖含量测定试剂盒(ben酚-硫酸)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 多糖含量试剂盒说明书 (货号:WS3950F 分光法 48 样) 一、产品简介: 糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与*酚缩合成橙 黄色化合物,且颜色稳定,在波长 488 nm 处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量 呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的 多糖含量,本方法可用于多糖含量的测定 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 粉剂×3 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部, 每支分别加 1.9mL 水溶解备用。 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅/金属浴、可调式移液器、浓硫酸(不允许快递)、研钵。 四、多糖含量的测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1 多糖待检液制备: a.组织样本: ① 样本烘干研磨过 40 目筛,称取 3mg 过筛后细末至 2mLEP 管中,加入 2mL 蒸馏水, 于沸水浴(95-100℃)加热 2 小时(若放在金属浴上面可用重物压盖防止 EP 管崩 开;间隔 20min 带防护手套轻轻晃动混匀几下),加热结束后取出放置至室温, 8000rpm 离心 5min② 取 0.2mL 上步离心后的上清液至新 EP 管中,再加入 1mL 乙醇混匀,于 4℃放置 1 小时,取出后 8000rpm 离心 5min 后弃上清,留沉淀; ③ 上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混匀几下(自备:取 80mL 乙醇溶于 20mL 馏水中),8000rpm 离心 5min 后弃上清,留沉淀可采用使 EP 管轻轻倒置于吸 水纸上约 5min 吸干剩余上清液,尽量避免沉淀损失)④ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸馏水,于沸水浴(95-100℃)加热直到沉淀全部溶 解(约 5min)即多糖待检液。 b.液体样本: ① 取 0.2mL 液体(可先做两个样本预测定,确定适合本批液体样本取样量 V2),至新 EP 管中,再加入 1mL 乙醇混匀(使乙醇在整个液体中占比至少 80%),于 4℃1 小时,取出后 8000rpm 离心 5min 后弃上清,留沉淀; ②上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混匀几下(自备:取 80mL 乙醇溶于 20mL 馏水中),8000rpm 离心 5min 后弃上清,留沉淀可采用使 EP 管轻轻倒置于吸 水纸上约 5min 吸干剩余上清液,尽量避免沉淀损失)③ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸馏水,于沸水浴(95-100℃)加热直到沉淀全部溶 解(约 5min)即多糖待检液。 2、上机检测:本试剂盒仅供科研使用 2 ① 可见分光光度计预热 30min,调节波长至 488nm,调节水浴锅或金属浴至 95-100℃② 向标准品中加入 1mL 蒸馏水即 1mg/mL 葡萄糖母液,用蒸馏水稀释 20 倍(1 份母液:19 份水)成 0.05mg/mL 葡萄糖,用于测定。在 EP 管中依次加入试剂(μL测定管 空白管(仅做一次) 多糖待检液 200 标准品 蒸馏水 200 试剂一 100 100 浓硫酸(务必缓慢加入) 500 500 混匀放入 95℃水浴 20min(封口膜缠紧,防止水分散失),冷 却至室温后,取全部澄清液体转移至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,于 488nm 读取吸光值 AΔA=A 测定管-A 空白管。 【注】:1. 如果ΔA 大于 1.5,需要将样本用蒸馏水稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数 D2. ΔA 值在零附近即低于 0.005,则可增加样本取样质量 W,则改变后的 W 需代 入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准方程为 y = 56.157x - 0.0036x 为标准品质量(mg),y 为吸光值ΔA2、按样本重量计算: 多糖(mg /g 重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D =1.781×(ΔA+0.0036)÷W×D 3、按质量分数(%)计算: 多糖(%重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D×10-3×100% =[0.1781×(ΔA+0.0036)÷W×D]% 4、按液体体积计算: 多糖(mg /mL 液体)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(V2×V1÷V)×10×D =2.313×(ΔA-0.0065)÷V2×D V---样品提取液总体积,2mLV1---测定时待检液体积,0.2mLV2---液体取样体积,mL10---②歩中取 0.2mL 处理后变成 2mL 体积; W---样本质量,gD---自行稀释倍数,未稀释即为 1W---样本质量,g附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中,再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 1mg/mL 的葡萄糖(母液需在两天内用且-20℃保存)。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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