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支链氨基酸转氨酶(BCAT)测定试剂盒微板法

更新时间:2024-06-12

简要描述:

支链氨基酸转氨酶(BCAT)测定试剂盒微板法
支链氨基酸转氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的Ⅳ类转氨酶。该酶分布十分广 泛,已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中

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支链氨基酸转氨酶(BCAT)测定试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferaseBCAT) 试剂盒说明书 (货号:WS3440W 微板法 48 样) 一、产品简介: 支链氨基酸转氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的类转氨酶。该酶分布十分广 泛,已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中。 支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化特异 L-型氨基酸氨基转移到α-酮戊二酸,形成相应的支链α-酮酸和谷*酸; 再用特异作用于谷*酸的酶复合体分解谷*酸,同时与显色剂反应生成黄色物质,该物质在 450nm 有最大吸收峰,进而得到支链氨基酸转氨酶(BCAT)的酶活性大小。 该酶催化反应:L-leucine + 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部, 再加 2.2mL 的蒸馏水充分溶解,仍 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试管底部, 再加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。4℃保存。 试剂三 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试管底部, 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。4℃保存。 试剂四 液体 20mL×1 4℃保存 试剂五 液体 2mL×1 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试管底部, 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。-20℃保存。 试剂七 液体 1mL×1 4℃保存 标准品 液体 mL×1 4℃保存 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分多的样本取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴 匀浆。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,300W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,按照细菌/细胞数量(104) :提取液体积(mL)500~1000:1 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 20 试剂三 10 10 试剂四 150 170 样本 100 100 混匀,37℃反应 60min(准确时间),立即于 95℃沸水中水浴 2min 后, 上下振动几下混匀后,12000rpm 室温离心 5 分钟,上清液待测。 ③ 显色反应:在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 提取液 100 100 试剂五 20 20 试剂六 10 10 试剂七 10 10 上清液 60 60 混匀,30℃反应 15min,立即于 450nm 处读取吸光值 AA=A 测定-A 对照。(每个样本需设一个自身对照 ) 【注】若A 差值在零附近徘徊,可以在显色反应阶段增加上清液(V3)的量(如增加到 120μL), 则提取液相应减少,改变后的 V3 重新代入公式计算;或延长第歩中 30℃反应时间 T(如由 60min 增加至 90min),则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y = 0.106x - 0.0032x 为谷*酸摩尔质量(nmol),y A2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 单位定义:每百万细菌或细胞每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/104 cell)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T=0.94×(ΔA+0.0032) V---提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.1 mLV2---反应总体积,0.3mLV3---显色阶段上清液体积,0.06mLT---反应时间,60min=1hW---样本质量,g500---细胞数量,百万;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(10nmol/μL)。 2 把母液稀释成六个梯度:0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根据实际样本来调整浓度。 3 依据显色反应阶段,测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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