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甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒

更新时间:2024-06-13

简要描述:

甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒
甲酸脱氢酶(FDH,EC 1. 2. 1. 2)属于 D-2-羟基酸脱氢酶类,广泛应用于辅酶 NADH 的再 生中。

甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒

甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenaseFDH)试剂盒说明书 (货号:WS5440F 紫外法 48 ) 一、产品简介: 甲酸脱氢酶(FDHEC 1. 2. 1. 2)属于 D-2-羟基酸脱氢酶类,广泛应用于辅酶 NADH 的再 生中。 本试剂盒利用甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸和 NAD+不可逆反应生成二氧化碳和 NADH,通 过检测 NADH 340nm 的生成速率,进而计算出甲脱氢酶(FDH)活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,每支再加 0.6mL 蒸馏水溶解。 试剂二 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,每支再加 0.6mL 蒸馏水溶解。 试剂三 液体 35mL×1 4℃保存 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液器、研钵、 冰和蒸馏水。 四、甲酸脱氢酶(FDH)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 细菌/培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数 量(104个):建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴, 功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm, 4℃离心 10min,取 上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照数量(104 个):提取液体积为 500~10001 的比例进行提取 ② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 紫外分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 ② 试剂解冻至室温(25℃)或于 25℃水浴中孵育 10min③ 在 1mL 石英比色皿(光径 1cm)中按照下表依次加入试剂: 试剂名称(µL测定管 样本 60 试剂一 20 试剂二 20 试剂三 620 混匀,立即于 340nm 处读取 A135℃条件 下孵育 10min 后读取 A2ΔAA2-A1【注】:1. ΔA 过小如小于 0.01,可增加样本体积 V1(如增至 120μL,则试剂三相应减 少),或延长反应时间 T(如:30min)或增加样本质量 W(如增加为 0.2g),重 新调整后 V1 T W 需代入公式重新计算。 2. ΔA 值大于 0.5 A2 值大于 1.8,需减少样本体积 V1(如减至 30μL,则试剂 三相应增加),或缩短反应时间 T(如:2min 或更短),重新调整后的样本体积本试剂盒仅供科研使用 2 V1 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(V1×Cpr)÷T=193×ΔA÷Cpr 2、按细菌/细胞密度计算: 酶活定义:每一万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=193×ΔA÷500 3、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体样本每分钟生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH 酶活(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=193×ΔA V1---加入样本体积,0.06mLV---加入提取液体积,1mLV2---反应体系总体积,7.2×10-4 Ld---光径,1cm500---细菌或细胞总数,万; W---样本质量,gε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmT---反应时间,10minCpr---蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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