土壤亚硝酸还原酶(S-NiR)试剂盒

土壤亚硝酸还原酶(S-NiR)试剂盒

土壤亚硝酸还原酶(S-NiR)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）试剂盒说明书 (货号：WS0130F 分光法 24 样) 一、产品简介： 土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用的关键酶，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原类 酶，参与亚硝酸盐至 NO 的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率， 为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 土壤亚硝酸还原酶可将 NO2-还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成（粉）红色化 合物的 NO2-减少，该（粉）红色物质在 540nm 有最大吸收峰，通过检测 540nm 处吸光 值的变化来反应土壤亚硝酸还原酶的活性。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格试剂名称 保存要求 备注 试剂一 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 有沉淀，临用前混匀即可 试剂三 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂会出现过饱和，临用前 25℃水 浴，5min 即可使用。 试剂四 A 液 21mL×1 瓶 4℃保存 临用前，可依据待检测样本数量，把 A 液和 B 液等比例混合成无色的反应 mix（注意观察，若变粉色，则不能 使用），两天之内用完。 B 液 21mL×1 瓶 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、天平、水浴锅、低温离心机、可调式 移液器。 四、土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备 取新鲜土样风干或者 37 度烘箱风干，先粗研磨，过 40 目筛网，备用。 【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻； 2、测定步骤 ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 无基质对照管 无土对照管 （仅做一次） 土样（g） 0.1 0.1 试剂一 400 400 蒸馏水 800 1200 800 试剂二 500 500 500 混匀，且务*用封口膜封口，25℃，培养 24h 试剂三 200 200 200 混匀，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待用本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应，②步得到的上清液用蒸馏水稀释 70 倍后，在 EP 管中依次加： 上清液 70 70 70 反应 mix 700 700 700 混匀，25℃反应 5min（准确时间），取出全部澄清液体至 1mL 玻璃比色 皿（光径 1cm）中，立即于 540nm 处读取 A 值，△A=A 无土对照管-（A 测定管-A 无基质对照管），（每个样本需做一个自身对照）。 【注】：若△A 值低于 0.01，可增加土壤样本取样质量 W（如由 0.1g 增至 0.25g），则改变 后的 W 需带入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 3.5252x - 0.0036；x 为标准品浓度（μmoL/mL），y 为吸光值△A。 2、单位定义：每克土样每天还原 1μmoL 的 NO2 ˉ量为一个酶活力单位。 S-NiR（μmoL/d/g 土壤）=[(△A+0.0036)÷3.5252×V1]÷W÷T×D =0.54×(△A+0.0036)÷W×70 3、单位定义：每克土样每天还原 1μg 的 NO2 ˉ量为一个酶活力单位。 S- NiR（μg/d/g 土壤）=[(△A+0.0036)÷3.5252×V1]÷W÷T×46×D =24.8×(△A+0.0036)÷W×70 V1---反应体系总体积，1900μL=1.9mL； T---反应时间，24h=1d； W---土样实际质量，g； D---稀释倍数，70 倍； 标准品的分子量---69； NO2 -的分子量---46。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（100μmol/mL）：把标准品*全溶解于 1mL 蒸馏水中（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段的测定管的加样顺序操作，根据结果即可制作标准曲线。