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谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-03

简要描述:

谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法
谷*酸合成酶(GOGAT)广泛分布于植物中,植物吸收的无机氮经硝酸还原糖(NR)和亚硝酸还原酶 (NIR)还原成 NH4+后,通过谷氨*胺合成酶(GOGAT)参与的 GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和 利用

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谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH-谷*酸合成酶(Glutamate synthase, NADH-GOGAT)试剂盒说明书 (货号:WS3040W 微板法 96 样) 一、产品简介: 谷*酸合成酶(GOGAT)广泛分布于植物中,植物吸收的无机氮经硝酸还原糖(NR)和亚硝酸还原酶 NIR)还原成 NH4+后,通过谷氨*胺合成酶(GOGAT)参与的 GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和 利用。GOGAT 一般包含两类:一类是多存在于叶绿体(叶片)中的 Fd-GOGAT,另一类是多存在于非绿 色组织(根)前质体中的 NADH-GOGATNADH-谷*酸合成酶(NADH-GOGATEC 1.4.1.14) 催化谷*酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸,形成两 分子的谷*酸;同时 NADH 氧化生成 NAD+,可以通过检测 340nm 吸光度的下降速率得出 NADH-GOGAT 的酶活性大小。 该酶催化的反应:L-glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+ 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试 管底部,每支再用 2.2mL 的提取液充 分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保 存,禁止反复冻融,三天内用完。 试剂二 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试 管底部,每个试剂瓶再用 7mL 的提取 液充分溶解,仍 4保存。 【注】:粉剂量在 mg 级别,使用前用手甩几次或者进行离心,打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、NADH-GOGAT 酶活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1粗酶液提取: 称取约 0.1g 组织(水分多的样本取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取,若样本 颜色较深(如植物叶片),可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5,可在样本制备过程中增加除色素步 骤:取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 80%乙醇冰浴匀浆,12000rpm4离心 10min弃掉色素较深的上清液;以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入 1mL 提取液, 混匀或再次冰浴匀浆,12000rpm4离心 10min,取上清置冰上待测。 2、测定步骤① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm② 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 20 试剂一 40 试剂二 140 混匀,340nm 下进行时长扫描,1min 时读取 A110min 后读取 A2 值,本试剂盒仅供科研使用 2 ΔA=A1-A2【注】1.A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会偏高),可以 适当减少样本加样量 V1(如减至 10μL,另外 10μL 用提取液补齐),则改变后的 V1 需代入计 算公式重新计算。或者减少试剂一的加样量(如减至 20μL,另外 20μL 用蒸馏水补齐) 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 12000rpm, 4℃离心 10min,上清液用于检测; 2. ΔA 的值大于 0.4,则需减少反应时间(如减少至 5min),则改变后的反应时间 T 需代入计 算公式重新计算。 3. 若下降趋势不稳定,可以每隔 20S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与计算, 相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GOGATnmol Glu/min/mg prot=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =6430.9×ΔA÷Cpr ÷T 2、按样本鲜重计算: 单位的定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GOGATnmol Glu /min/g 鲜重)=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V) ÷T =6430.9×ΔA÷W÷T V--提取液体积,1 mLV1--加入样本体积,0.02 mLV2--反应总体积,2×10-4 Ld--96 孔板光径,0.5cmε--NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmT--反应时间,本实验中是 10min,若线性区间的时间改变则以实际检测时间代入公式计算; Cpr--样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒; 2----每合成 2nmol Glu 1nmol NADH 被氧化; W--样本质量,g

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