谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒,微板法

谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒,微板法

谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书 （货号：WS1040W 微板法 96 样） 一、产品简介： 谷胺酰胺合成酶（GS，EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，植物吸收的 无机氮经硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）还原成 NH4+后，通过谷胺酰胺合成酶（GS）参与的 GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和利用。 谷胺酰胺合成酶（GS）在 ATP 和 Mg2+存在下，催化铵离子和谷*酸合成*氨酰胺；谷*酰胺进一步转 化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰，进而得到谷胺酰胺合 成酶（GS）的酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体 34mL×1 瓶 4℃保存 临用前 37℃预热 10min，充分混匀 试剂二 液体 34mL×1 瓶 4℃保存 临用前 37℃预热 10min，充分混匀 试剂三 粉剂 mg×2 瓶 -20℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底 部，每瓶再加入 13mL 蒸馏水充分溶解待 用，仍-20℃保存。 试剂四 液体 45mL×1 瓶 4℃保存 [注]：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、谷胺酰胺合成酶（GS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌/细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例提取。 2、 上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂（μL） 测定管 对照管 样本 200 200 试剂一 320 试剂二 320本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 120 120 混匀，37℃水浴 30min 试剂四 200 200 混匀，反应 2min，8000rpm，4℃离心 10min，取 200μL 上清液 于 96 孔板中，540nm 处分别读取吸光值 A，△A=A 测定管-A 对 照管（每个测定管须设一个对应的对照管）。 【注】：若△A 值低于 0.005，可增加样本加样体积 V1（如由 200μL 增至 400μL，则试剂一和试 剂二相应减少 120μL，试剂三相应减少 80μL），保持反应总体积不变。或增加样本取样 质量 W（由 0.1g 增加到 0.2g 或更高）。则改变后的 V1 和 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 GS(U/mg prot)=ΔA÷(Cpr×V1)÷0.005÷T =33.3×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 GS(U/g 鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.005÷T =33.3×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每百万细菌或细胞在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 GS(U/104 cell)=ΔA÷0.005÷(500×V1÷V)÷T=0.07×ΔA V----加入提取液体积，1 mL； V1----加入样本体积，0.2mL； T----反应时间，30 min； W----样本质量，g； 500----细胞数量，百万； Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。