谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒

谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒

谷an酰胺合成酶(GS)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书 （货号：WS1040F 分光法 48 样） 一、产品简介： 谷胺酰胺合成酶（GS，EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，植物吸收 的无机氮经硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）还原成 NH4+后，通过谷胺酰胺合成酶（GS）参 与的 GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和利用。 谷胺酰胺合成酶（GS）在 ATP 和 Mg2+存在下，催化铵离子和谷*酸合成谷*酰胺；谷*酰胺进一步 转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰，进而得到谷胺酰胺 合成酶（GS）的酶活性大小。 二、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水。 三、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 临用前 37℃预热 10min，充分溶解 试剂二 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 临用前 37℃预热 10min，充分溶解 试剂三 粉剂 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再 加入 14mL 蒸馏水充分溶解待用，仍-20℃保存。 试剂四 液体 22mL×1 瓶 4℃保存 【注】粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 四、谷胺酰胺合成酶（GS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌/细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例提取 2、 上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂（μL） 测定管 对照管 样本 200 200 试剂一 320 试剂二 320 试剂三 120 120] 本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，37℃水浴 30min 试剂四 200 200 混匀，反应 2min，8000rpm，4℃离心 10min，全部上清液转 移至 1ml 玻璃比色皿中，于 540nm 处分别读取吸光值 A， ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管须设一个对应的对照管）。 【注】：若△A 值低于 0.01，可增加样本加样体积 V1（如由 200μL 增至 400μL，则试剂一和试剂 二相应减少 120μL，试剂三相应减少 80μL），保持反应总体积不变。或增加样本取样质 量 W（由 0.1g 增加到 0.2g 或更高）。则改变后的 V1 和 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 GS(U/mg prot)=ΔA÷(Cpr×V1)÷0.01÷T=16.7×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 GS(U/g 鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=16.7×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每百万细菌或细胞在每分钟内使 A540 吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 GS(U/104 cell)=ΔA÷0.01÷(500×V1÷V)÷T=0.033×ΔA V----加入提取液体积，1 mL； V1----加入样本体积，0.2mL； T----反应时间，30 min； W----样本质量，g； 500----细胞数量； Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。