Caspase-3活性测定试剂盒,微板法

Caspase-3活性测定试剂盒,微板法

Caspase-3活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 Caspase-3 活性测定试剂盒说明书 (货号：WS5121W 微板法 48 样) 一、产品简介： Caspase-3 又称 CPP32、Yama 或 apopain，属于 CED-3 亚家族，是细胞凋亡过程中的一 个关键酶。 利用 Caspase-3 分解底物 Ac-DEVD-pNA 产生黄色的对硝基苯胺（pNA），后者在 405nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出 Caspase-3 酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存条件 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 0.5mL×1 支 -20℃保存 低温放置易冻住，放置室温使其 解冻成液体再用，用不完的试剂 分装后-20℃保存。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重做标曲则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、Caspase-3 活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为 500-1000：1 的比例进行提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 40 试剂一 150 试剂二 10 混匀，于 405nm 处读取 A1 值，37℃反应 1h 后读取 A2 值。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：1. 加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若 A2 值大于 1.5，可减少样本加 样量 V1（如减至 10μL，则试剂一相应增加），或缩短反应时间 T（如由 1h 减至 30min），则改 变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 2. 若ΔA 小于 0.01，可延长反应时间 T（如由 1h 增至 2h 或更长），则改变后的 T 需代入公式重 新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0291x - 0.0004：x 为标准品（对硝基苯胺）(nmoL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 Caspase-3(nmoL/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(W×V1÷V)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 Caspase-3 (nmoL/h/mgprot)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(V1×Cpr)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷Cpr 4、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位（U）。 Caspase-3 (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(500×V1÷V)÷T=1.72×(ΔA+0.0004) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04mL； T---反应时间，1h； W---样本质量，g； 500---细胞数量； D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.5mL 乙醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.5mL 的蒸馏水混匀，得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际来 调整浓度。 3 40μL 标准品+160μL 试剂一，混匀后于 405nm 处读取 A 值，依据结果即可制作标准 曲线。 ΔA=A2-A1。