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Caspase-3活性测定试剂盒

更新时间:2024-05-30

简要描述:

Caspase-3活性测定试剂盒
Caspase-3 又称 CPP32、Yama 或 apopain,属于 CED-3 亚家族,是细胞凋亡过程中的 一个关键酶。

Caspase-3活性测定试剂盒

Caspase-3活性测定试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 Caspase-3 活性测定试剂盒说明书 (货号:WS5121F 分光法 24 ) 一、产品简介: Caspase-3 又称 CPP32Yama apopain,属于 CED-3 亚家族,是细胞凋亡过程中的 一个关键酶。 利用Caspase-3分解底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的对硝基苯胺(pNA),后者在405nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率即可得出 Caspase-3 酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存条件 备注 提取液 液体 30mL×1 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 4℃保存 试剂二 液体 0.5mL×1 -20℃保存 低温放置易冻住,放置室温使 其解冻成液体再用,用不完的 试剂分装后-20℃保存。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重做标曲则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液器、天平、 研钵、冰和蒸馏水。 四、Caspase-3 活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备① 组织样本: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4×12000rpm 离心 10min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照数量(104):提取液体积(mL)500-10001 的比例进行提取 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 405nm② 在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 【注】:1. 加完试剂二即启动反应,所以试剂二加完混匀后立即检测,若 A2 值大于 1.5,可减少样本加 样量 V1(如减至 40μL,则试剂一相应增加),或缩短反应时间 T(如由 1h 减至 30min),则改 变后的 V1 T 需代入公式重新计算。 2. ΔA 小于 0.01,可延长反应时间 T(如由 1h 增至 2h 或更长),则改变后的 T 需代入公式重新 计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0128x + 0.0024x 为标准品(对硝基苯胺)(nmoL)y ΔA2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。 Caspase-3 (nmoL/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0024)÷0.0128]÷(W×V1÷V)÷T=976.6×(ΔA+0.0024)÷W 3、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。 Caspase-3 (nmoL/h/mgprot)=[(ΔA+0.0024)÷0.0128]÷(V1×Cpr)÷T=976.6×(ΔA+0.0024)÷Cpr 4、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位(U)。 Caspase-3 (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0024)÷0.0128]÷(500×V1÷V)÷T=1.95×(ΔA+0.0024) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.08mLT---反应时间,1hW---样本质量,g500---细胞数量; D---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):临用前甩几下或离心,使粉体落入底部,加入 0.5mL 乙醇,涡旋震荡溶解后再加入 0.5mL 的蒸馏水混匀,得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根据实际来调 整浓度。 3 80μL 标准品+620μL 试剂一,混匀后于 405nm 处读取 A 值,依据结果即可制作标准 曲线。 试剂名称(μL测定管 样本 80 试剂一 600 试剂二 20 混匀,于 405nm 处读取 A1 值,37℃反应 1h 读取 A2 值。ΔA=A2-A1

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