糜蛋bai酶试剂盒,微板法

糜蛋bai酶试剂盒,微板法

糜蛋bai酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 糜*白酶/胰凝*蛋白酶（Chymotrypsin）试剂盒说明书 (货号：WS1121W 微板法 96 样) 一、产品简介： 糜*白酶（EC 3.4.21.1）又称胰*乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，具有肽链 内切酶的作用，通过切断蛋白质肽链中*氨酸、苯丙*酸的羧端肽链作用，专一水解羧端芳 香族氨基酸。临床上糜*白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手 术后伤口愈合。 本试剂盒采用糜蛋*酶催化水解 N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-苯丙*酸对硝基酰苯 胺（SAAPFpNA）生成对硝基苯胺，后者在 405nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速 率即可得出糜*白酶的活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存条件 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 0.6mL×1 支 -20℃保存 若凝固则可于 37℃水浴至融化， 再加 3.8mL 蒸馏水混匀备用。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重做标曲，则用到该试剂。 三、所需的主要仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、糜蛋*酶/胰凝*蛋白酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×4000rpm 离心 5min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min， 取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。 ② 所有试剂解冻至室温。在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 30 试剂一 130 试剂二 40 混匀， 立即于 405nm 处测定吸光值 A1，37℃ 条件下反应 5min 后读取 A2，ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】1 .若ΔA 在零附近徘徊，可以延长反应时间 T（如延长至 10min 后读取 A2）或增加样本量 V1（如增 至 60μL，则试剂一相应减少），则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若ΔA 大于 0.5，可缩短反应时间 T（如缩至 2min 后读取 A2）或减少样本量 V1（如减至 10μL， 则试剂一相应增加），则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0259x - 0.001：x 为标准品(nmoL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 糜*白酶/胰凝乳*白酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(W×V1÷V)÷T =257.4×(ΔA+0.001)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 糜*白酶/胰凝乳*白酶(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(V1×Cpr)÷T =257.4×(ΔA+0.001)÷Cpr 4、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位（U）。 糜蛋*酶/胰凝乳*白酶(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷V1÷T=257.4×(ΔA+0.001) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.03 mL； W---样本质量，g； T---反应时间，5min； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（50μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.5mL 乙醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.5mL 的蒸馏水混匀，得到 50μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根据实际来调 整浓度。 3 30μL 标准品+170μL 试剂一，混匀后于 405nm 处读取 A 值，依据结果即可制作标准 曲线。