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胰蛋bai酶试剂盒-可见显色法,微板法

更新时间:2024-05-29

简要描述:

胰蛋bai酶试剂盒-可见显色法,微板法
胰蛋*酶(EC 3.4.4.4) 是蛋白酶的一种,可以催化水解酰胺键。是一种重要的消化酶。 胰*白酶催化水解 N-苯甲酰-DL-精*酸-对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)生成对硝基苯胺,后者 在 405nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率即可得出胰*白酶的活性大小。

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本试剂盒仅供科研使用 1 胰*白酶(Trypsin)试剂盒说明书 (货号:WS9021W 微板法 96 ) 一、产品简介: 胰蛋*酶(EC 3.4.4.4) 是蛋白酶的一种,可以催化水解酰胺键。是一种重要的消化酶。 胰*白酶催化水解 N-苯甲酰-DL-精*酸-对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)生成对硝基苯胺,后者 405nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率即可得出胰*白酶的活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存条件 备注 试剂一 液体 30mL×1 4℃保存 试剂二 液体 0.6mL×1 -20℃保存 凝固则可于 37℃水浴至融化。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、胰*白酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定了解本批样品情况熟悉实验流程避免实验样本 和试剂浪费1、样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 生理盐水,进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min,取上清, 置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加 1mL 生理盐水,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:若是澄清液体,直接检测,若液体样本浑浊,需 4℃×12000rpm,离心 10min取上清液检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 405nm② 所有试剂解冻至 37℃37℃水浴 15-30min反应 mix 制备:试剂二若凝固则可于 37℃水浴至融化,再按照试剂一:试剂二=0.97mL0.03mL 混匀成反应 mix,现配现用,用多少量配制多少反应 mix④ 在 96 孔板中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 30 反应 mix 170 混匀, 立即于 405nm 处测定吸光值 A137℃ 条件下反应 10min 后读取 A2ΔA=A2-A1【注】若ΔA 在零附近徘徊,可以延长反应时间 T(如延长至 20min 后读取 A2)或增加样本量 V1 (如增至 50μL,则反应 mix 相应减少),则改变后的 T 和样本量 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0259x - 0.001x 为标准品(nmoL)y ΔA2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。 胰*白酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(W×V1÷V)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷W 3、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。 胰*白酶(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(V1×Cpr)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷Cpr 4、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。 胰*白酶(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×(ΔA+0.001) 5、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位(U)。 胰*白酶(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷V1÷T=128.7×(ΔA+0.001) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.03 mLW---样本质量,g500--细菌或细胞总数,500 万; T---反应时间,10minCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):临用前甩几下或离心,使粉体落入底部,加入 0.1mL 醇,涡旋震荡溶解后再加入 0.9mL 的蒸馏水混匀,得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。 3 30μL 标准品+170μL 试剂一,混匀后于 405nm 处读取 A 值,依据结果即可制作标准曲线。

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