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肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-27

简要描述:

肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法
肉桂醇脱氢酶(CAD,EC 1.1.1.195)是作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶, 与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切。

肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法

肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肉桂醇脱氢酶( Cinnamyl-alcohol dehydrogenaseCAD)试剂盒说明书 WS2001W 微板法 96 样) 一、产品简介: 肉桂醇脱氢酶(CADEC 1.1.1.195)是作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶, 与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切。本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方 法:CAD 催化肉桂醇和 NADP+生成肉桂醛和 NADPH,进而与特异的显色剂反应产生有色 物质,通过检测有有色物质的增加速率,进而计算出 CAD 酶活性的大小。 二、试剂盒组分与配制: 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、肉桂醇脱氢酶(CAD)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备 ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、 上机检测 ① 酶标仪预热 30min 以上,温度设定 37℃,调节波长至 450nm② 试剂放在 37℃水浴 5min③ 按照下表在 96 孔板中依次加入试剂: 【注】:若ΔA 在零附近徘徊,可延长反应时间 T(如:40min 或更长), 或加大样本量 V1(如增至 50μL,则试剂三相应减少),重新 调整后的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 4℃保存 试剂二 液体×1 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前加入 14mL 提取液充分溶解,制备 反应 mix;用不完的试剂 4保存; 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 试剂名称(μL测定管 样本 20 试剂一 40 试剂二 10 试剂三 130 混匀,立即 450nm 下读取 A1 值,避光孵育 30min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1本试剂盒仅供科研使用 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y=1.5919x-0.0046x NADPH 摩尔浓度:μmol/mLy ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:在 37℃,每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CADnmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(V1×Cpr) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位的定义:在 37℃,每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CADnmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(W ×V1÷V) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷W 4、液体样本中 CAD 活力计算: 单位的定义:在 37℃,每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CADnmol/min /mL)=[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷V1÷T=20.94×(ΔA+0.0046) V:加入提取液体积,1 mLV1:加入样本体积,0.02 mLT:反应时间,30 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(0.5μmol /ml):向标准品 EP 管里面加入 0.6ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5.μmol/ml。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。 2

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