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甘油激酶(GK)活性试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-27

简要描述:

甘油激酶(GK)活性试剂盒,微板法
甘油激酶(GK,EC 2.7.1.30)是甘油代谢中的限速酶,催化甘油磷酸化产生 3-磷酸甘油,3-磷酸甘油在 3-磷酸甘油脱氢酶的作用下产生磷酸二羟丙酮,进入糖酵解途径氧化分解释放能量。该酶的缺乏将直接导致细胞不能利用甘油。

甘油激酶(GK)活性试剂盒,微板法

甘油激酶(GK)活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 甘油激酶(GK)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS9190W 微板法 96 样) 一、产品简介: 甘油激酶(GKEC 2.7.1.30)是甘油代谢中的限速酶,催化甘油磷酸化产生 3-磷酸甘 油,3-磷酸甘油在 3-磷酸甘油脱氢酶的作用下产生磷酸二羟丙酮,进入糖酵解途径氧化分 解释放能量。该酶的缺乏将直接导致细胞不能利用甘油。 本试剂盒采用甘油激酶催化 Mg-ATP 依赖的甘油磷酸化为 3-磷酸甘油,3-磷酸甘油在 磷酸甘油氧化酶的作用下产生过氧化氢,过氧化氢与显色剂反应在 510nm 处有最大吸收 峰。通过测定 510nm 处的增加速率即可得出甘油激酶的酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂三 液体 6mL×1 4℃保存 试剂四 液体 9mL×1 4℃保存 试剂五 液体 mL×1 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,临用前加 2.2mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 标准品 液体 1 mL×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、甘油激酶(GK)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g)到研钵内,加入 1mL 提取液, 在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取) ② 细菌/真菌样本:先收集细菌/真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌/真菌加 1mL 提取液;冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取) ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 510nm② 在 96 孔板中依次加入下列试剂:本试剂盒仅供科研使用 2 【注】:加完试剂五即启动反应,所以试剂五加完需立即混匀检测,若ΔA 小于 0.05,可增加样本上样量 V1,试剂四相应减少保持原体系不变(如样本上样量为 20μL ,试剂四为 80μL);或延长反 应时间 T(如延长至 10min 或更长),则改变后的 V1 T 需带入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.1066x-0.0277x H2O2标准品浓度(μmoL/mL)y ΔA2、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。 GK(μmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(W×V1÷V)÷T =1.88×(ΔA+0.0277)÷W 3、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。 GK(μmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1.88×(ΔA+0.0277)÷Cpr 3、按细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。 GK(μmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(500×V1÷V)÷T=0.004×(ΔA+0.0277) 4、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。 GK(μmoL/min/mL)= [(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷V1÷T=1.88×(ΔA+0.0277) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.01mLT---反应时间,5 minW---样本质量; 500---细胞数量; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的蛋白含量测定试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1. 用蒸馏水把母液(250mM)稀释成以下浓度梯度的标准品:0,2,4,6,8,10mM。也可根 据实际情况来调整标准品浓度。 2. 按照测定管(样本替换为标准品)加样体系操作,依据结果即可制作标准曲线。 试剂名称(μL测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 60 试剂四 90 混匀,37避光静止 5min试剂五 20 混匀,37℃下,立即于 510nm 读取吸光值 A1,避光孵育 5min 后读取 A2ΔA=A2-A1

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