脂肪酸合成酶（FAS）试剂盒

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脂肪酸合成酶（FAS）试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，FAS）试剂盒说明书 （货号:WS3290F 紫外法 24 样） 一、产品简介： 脂肪酸合成酶（FAS，EC 2.3.1.85）是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶 A 和丙二酰辅 酶 A 而生成长链脂肪酸。FAS 普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺 和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。 FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成长链脂肪酸和 NADP+；NADPH 在 340nm 有吸收峰，通过测定 340nm 光吸收下降速率，进而计算 FAS 活性大小。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 用前摇匀再用。 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂二 粉剂 mg×2 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分 别加 0.3mL 蒸馏水溶解备用。用不完的 试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融， 一周内用完。 试剂三 液体 18mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 三、所需的仪器和用品： 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰。 四、脂肪酸合成酶（FAS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的果实样本可取 0.2-0.3g），加入 1mL 提取液（用前摇匀再 用），进行冰浴匀浆，13000rpm，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： 1 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2 所有试剂解冻至室温（25℃），在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 60 试剂一 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 20 试剂三 580 混匀，室温（25℃）孵育反应 10min。 试剂四 20 混匀，室温（25℃）于 340nm 处立即读取 A1，15min 后读取 A2。△A=A1-A2。 【注】1. 若△A 值低于 0.008，可增加样本加样体积 V1（如增至 100μL，则试剂三相应减少，单需控 制 A1 值低于 2）或延长孵育时间（如延长至 30min）再读取 A2 值。 2. 若 A1 值超过 2，需减少样本加样体积 V1（如减至 40μL，则试剂三相应增加），且△A 应小 于 0.3。 3. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算， 相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活单位。 FAS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=125×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 FAS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=125×ΔA÷W 3、按细菌/细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 FAS(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.25×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.06mL； V2---反应体系总体积，7×10-4 L； d---光径，1cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，15min； 500---细胞数量，百万； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。