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3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-27

简要描述:

3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒,微板法
3-磷酸甘油酯酶(GPP,EC3.1.3.21)催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油,是甘油合成过程中的最后一步酶促反应,该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。

3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒,微板法

3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS8190W 微板法 48 样) 一、产品简介: 3-磷酸甘油酯酶(GPPEC3.1.3.21)催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油,是甘 油合成过程中的最后一步酶促反应,该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。 本试剂盒采用 3-磷酸甘油为底物,用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸 根离子的量,进而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,临用前加 6mL 蒸馏水溶解备 用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 液体 6mL×1 4℃保存 试剂三 A:粉体 mg×1 B:液体 2mL×1 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 1.8mL B 液,再加 23.2mL 的蒸馏水,混 匀溶解备用。用不完的试剂 4℃ 保存,若试剂变色则舍弃。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿, 免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、EP 管、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g)到研钵内,加入 1mL 提取液,在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 []:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌/真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 []:也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 700nm② 在 EP 管中依次加入下列试剂:本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应,在 96 孔板中加入: 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.5117x + 0.0026x 是标准品摩尔质量(μmol/mL, y A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(A-0.0026)÷0.5117×V2] ÷V1×Cpr÷T=15.63×(A-0.0026)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/g 鲜重)= [(A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(W× V1÷V)÷T=15.63×(A-0.0026)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.031×(A-0.0026) 5、按液体体积计算: 定义:每小时每毫升液体分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mL)=[( A-0.0026)÷0.5117×V2]÷V1÷T=15.63×(A-0.0026) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.05mL V2---酶促反应总体积,0.2mLT---反应时间,1/2 小时; W---样本鲜重,g500---细菌或细胞总数,500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1. 制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。 2. 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 50 提取液 50 50 试剂一 50 50 混匀,37℃孵育 30min试剂二 50 50 样本 50 混匀,12000rpm4℃离心 5min,取上清待测。 上清液 50 50 试剂三 200 200 混匀,室温静置 3min700nm 下读取各管吸光值 AA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。

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