更新时间:2024-05-27
3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒3-磷酸甘油酯酶(GPP,EC3.1.3.21)催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油,是甘油合成过程中的最后一步酶促反应,该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。
3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒
3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS8190F 分光法 24 样) 一、产品简介: 3-磷酸甘油酯酶(GPP,EC3.1.3.21)催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油,是甘 油合成过程中的最后一步酶促反应,该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。 本试剂盒采用 3-磷酸甘油为底物,用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸 根离子的量,进而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 35mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,临用前加 3.6mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 液体 3mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 3mL×1 瓶 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 2.7mL 的 B 液,再加 34.8mL 的蒸馏水,混 匀溶解备用。用不完的试剂 4℃ 保存,若试剂变色则舍弃。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿, 免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、 研钵、冰。 四、α-磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g)到研钵内,加入 1mL 提取液,在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 [注]:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌/真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm, 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 [注]:也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取) ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 700nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入下列试剂:本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应,在 EP 管中加入: 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.6624x - 0.003,x 是标准品摩尔质量(μmol/mL), y 是△A。 2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=12.08×(△A+0.003)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/g 鲜重)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(W× V1÷V)÷T=12.08×(△A+0.003)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△A+0.003) 5、按液体体积计算: 定义:每小时每毫升液体分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mL)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷V1÷T=12.08×(△A+0.003) V---加入提取液体积,1mL; V1---加入样本体积,0.06mL ; V2---酶促反应总体积,0.24mL; T---反应时间,1/2 小时; W---样本鲜重,g; 500---细菌或细胞总数,500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1. 制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。 2. 把母液稀释成六个浓度:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂名称(μL) 测定管 对照管 样本 60 提取液 60 60 试剂一 60 60 混匀,37℃孵育 30min。 试剂二 60 60 样本 60 混匀,12000rpm,4℃离心 5min,取上清待测。 上清液 150 150 试剂三 600 600 混匀,室温静置 3min,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿 (光径 1cm),700nm 下读取各管吸光值 A, △A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。