3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS8190F 分光法 24 样） 一、产品简介： 3-磷酸甘油酯酶（GPP，EC3.1.3.21）催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油，是甘 油合成过程中的最后一步酶促反应，该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。 本试剂盒采用 3-磷酸甘油为底物，用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸 根离子的量，进而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 35mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，临用前加 3.6mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 液体 3mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 3mL×1 瓶 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 2.7mL 的 B 液，再加 34.8mL 的蒸馏水，混 匀溶解备用。用不完的试剂 4℃ 保存，若试剂变色则舍弃。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、 研钵、冰。 四、α-磷酸甘油酯酶（GPP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取） ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 700nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应，在 EP 管中加入： 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.6624x - 0.003，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2] ÷（V1×Cpr）÷T=12.08×(△A+0.003)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/g 鲜重)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(W× V1÷V)÷T=12.08×(△A+0.003)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△A+0.003) 5、按液体体积计算: 定义：每小时每毫升液体分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mL)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷V1÷T=12.08×(△A+0.003) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.06mL ； V2---酶促反应总体积，0.24mL； T---反应时间，1/2 小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1. 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2. 把母液稀释成六个浓度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 60 提取液 60 60 试剂一 60 60 混匀，37℃孵育 30min。 试剂二 60 60 样本 60 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，取上清待测。 上清液 150 150 试剂三 600 600 混匀，室温静置 3min，全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿 （光径 1cm），700nm 下读取各管吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。