线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mt-GPD）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS7190W 微板法 96 样） 一、产品简介： 线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mt-GPD）存在于线粒体中，在 3-磷酸甘油途径中起重要 作用，催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羟丙酮，同时生成的电子和氢进入呼吸链参与氧 化磷酸化；在电子传递体（PMS）存在下，使噻唑蓝（MTT）还原生成蓝色产物，通过 检测该蓝色产物在 550nm 处的增加速率，即可得出 mt-GPD 活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 0.2mL×1 支 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸馏水溶解。 一周内用完。 试剂五 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 每支加 0.3mL 的蒸馏水溶解。 一天内用完。 试剂六 液体 17mL×1 瓶 4℃保存 试剂七 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mtGPD）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）： ① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌/细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀 浆，转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min。 ② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(上 清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的酶活性（此步可选做）)，留下沉淀 （沉淀即为线粒体）。 ③ 在沉淀（线粒体）中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），液体置于冰上用于线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶 （mtGPD）活性测定。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按照 细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm。 ② 在 96 孔板中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂四 10 试剂五 10 试剂六 150 试剂七 10 混匀后立即在 550nm 处读取 A1 值，5min 后读取 A2。 ΔA=A2-A1。 【注】：加完试剂四即启动反应，所以试剂四加完需立即检测，若ΔA 小于 0.05， 则增加样本上样量 V1，试剂三相应减少保持原体系不变（如样本上样量为 40μL 时，试剂三为 130μL）。则改变后的 V1 需带入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、 按样本蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。 mtGPD 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T=493.8×ΔA÷Cpr 2、 按样本鲜重计算 酶活定义：每克组织每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。 mtGPD 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V)÷T=99.8×ΔA÷W 3、 按细菌或细胞密度计算 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活单位。 mtGPD 活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.2×ΔA ε---还原型 MTT 的摩尔消光系数，8.1×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，0.202mL； V1---加入样本体积，0.02 mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，5min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。