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线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-24

简要描述:

线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法
线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mt-GPD)存在于线粒体中,在 3-磷酸甘油途径中起重要作用,催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羟丙酮,同时生成的电子和氢进入呼吸链参与氧化磷酸化

线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mt-GPD)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS7190W 微板法 96 样) 一、产品简介: 线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mt-GPD)存在于线粒体中,在 3-磷酸甘油途径中起重要 作用,催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羟丙酮,同时生成的电子和氢进入呼吸链参与氧 化磷酸化;在电子传递体(PMS)存在下,使噻唑蓝(MTT)还原生成蓝色产物,通过 检测该蓝色产物在 550nm 处的增加速率,即可得出 mt-GPD 活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 4℃保存 试剂二 液体 20mL×1 4℃保存 试剂三 液体 0.2mL×1 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 每支加 0.6mL 的蒸馏水溶解。 一周内用完。 试剂五 粉剂 mg×4 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 每支加 0.3mL 的蒸馏水溶解。 一天内用完。 试剂六 液体 17mL×1 4℃保存 试剂七 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mtGPD)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、线粒体制备(提示:整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境): ① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌/细胞,加入 1mL 试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀 浆,转移至离心管后于 4×700g 离心 10min② 弃沉淀,上清液移至另一离心管中,4×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的酶活性(此步可选做)),留下沉淀 (沉淀即为线粒体)。 ③ 在沉淀(线粒体)中加入200μL试剂二和2μL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),液体置于冰上用于线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶 mtGPD活性测定【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取,或按照 细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 550nm② 在 96 孔板中依次加入下列试剂:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 20 试剂四 10 试剂五 10 试剂六 150 试剂七 10 混匀后立即在 550nm 处读取 A1 值,5min 后读取 A2ΔA=A2-A1【注】:加完试剂四即启动反应,所以试剂四加完需立即检测,若ΔA 小于 0.05则增加样本上样量 V1,试剂三相应减少保持原体系不变(如样本上样量为 40μL ,试剂三为 130μL)。则改变后的 V1 需带入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、 按样本蛋白浓度计算 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活性单位。 mtGPD 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(V1×Cpr) ÷T=493.8×ΔA÷Cpr 2、 按样本鲜重计算 酶活定义:每克组织每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活性单位。 mtGPD 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(W×V1÷V)÷T=99.8×ΔA÷W 3、 按细菌或细胞密度计算 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝(MTT)定义为一个酶活单位。 mtGPD 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.2×ΔA ε---还原型 MTT 的摩尔消光系数,8.1×103 L/mol/cmd---96 孔板光径,0.5cmV---加入提取液体积,0.202mLV1---加入样本体积,0.02 mLV2---反应体系总体积,2×10-4 LT---反应时间,5minW---样本质量,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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