蛋白含量(SP)试剂盒(双缩脲法),微板法

蛋白含量(SP)试剂盒(双缩脲法),微板法

蛋白含量(SP)试剂盒(双缩脲法),微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 双缩脲法蛋白含量测定试剂盒说明书 (货号：WS2340W 微板法 96 样) 一、产品简介： 在碱性溶液中，凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)或与此相似基团的化合 物均与二价铜离子作用，络合物呈紫色，这一反应称双缩脲反应。蛋白质分子含有众多肽 键(—CONH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比， 经光谱扫描 540nm 为最大吸波长。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂 A 液体 9mL×1 瓶 4℃避光保存 依据实验用量，临用前试剂 A:B:超纯水=5:3:2 的比例混匀 成反应 mix，4℃避光保存两周。 试剂 B 液体 5.5mL×1 瓶 4℃保存 标准品 液体 1mL×1 支 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、恒温水浴锅（恒温培养箱）、移液器和蒸馏水。 四、蛋白含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清， 即待测液。 ② 细菌或细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，即待测液。 ③ 液体样本：澄清无色液体样品可以直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测 ① 酶标仪预热 30min，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。 ② 可先取 2 个样本预测，确定适合本批样本的浓度，若需要可用蒸馏水进行稀释，稀释 倍数 D 代入公式计算。 ③ 在 2mL 的 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 标准管 （只做一次） 空白管 （只做一次） 样本 20 标准品 20 蒸馏水 20 反应 mix 180 180 180 混匀，于 37℃保温 10min，全部转移到 96 孔板， 于 540nm 处测定吸光值 A，△A= A 测定-A 空白。本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算： 1、蛋白含量(mg/g 鲜重)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(W×V1÷V)×D =10×△A÷(A 标准-A 空白)÷W×D 2、蛋白含量 (mg/mL)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V)×D =10×△A÷(A 标准-A 空白)×D 3、蛋白含量(μg/104 cell))=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V×500)×D =0.02×△A÷(A 标准-A 空白)×D C 标准---蛋白标准品浓度，10mg/mL； V---提取液体积：1mL； V1---加入粗提液体积：0.02mL； W---样本质量：g； D---稀释倍数； 500--细菌或细胞总数，500 万。 注意事项： 1 本法可测定范围为 1-10mg 蛋白质，适用于精度不高的蛋白质含量测定。 2 硫酸铵、Tris 缓冲液、EDTA、PVP 和一些氨基酸等物质会对测定造成干扰。 3 工作液长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。