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蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-22

简要描述:

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法
蔗糖是重要的光合产物,是植物体内运输的主要物质,优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,EC 2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之一。

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖合成酶(合成方向;SS-Ⅱ)试剂盒说明书 (货号:WS2150W 微板法 48 样) 一、产品简介: 蔗糖是重要的光合产物,是植物体内运输的主要物质,优势碳水化合物的暂贮形式之一。 蔗糖合成酶(Sucrose SynthaseEC 2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化 蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其合成方向 SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具 有重要意义。 SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体 UDPG 反应生成蔗糖,采用蔗糖与间苯*fen反应生成 的有颜色产物在 480nm 下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色深浅成正比。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60ml×1 4℃保存 试剂一 液体 2.1ml×1 -20℃保存 试剂二 液体 1ml×1 4℃保存 试剂三 液体 20ml×1 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,每 瓶加入 4mL 蒸馏水充分溶解,现配 现用,一周内用完。 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、蒸馏水。 四、蔗糖合成酶(SS-Ⅱ)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 12,000rpm 4℃离心 10min,取上清作为待测样品。 【注意】 若样本含糖量高,可引起 A 对照值较大如超过 1.6,即检测背景值过高会影响检测,可在样本 制备过程中增加除糖步骤:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀,4℃放置 5min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 液体样本:直接测定。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 480nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 40 蒸馏水 40 样本 20 20 37℃水浴 20min 试剂二 10 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二需直接加到反应液里面,且务必混匀(可用枪头吸 打),95℃水浴煮沸 10min(可用封口膜缠紧,防止水分散 失),冷却至室温。 试剂三 200 200 试剂四 60 60 混匀,95℃水浴 20min,冷却后,取 200μL 96 孔板中, 480nm 下测定。ΔA=A 测定管-A 对照管(每个测定管需设 一个对照管)。 【注】:若ΔA 值过小如在零附近徘徊,可延长 37℃水浴时间 T(如 40min 或更长)或增加样本取样 W(如增至 0.2g),或者增加样本加样体积 V1(如 40μL,则试剂三相应减少),相应的变 量重新代入计算公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0053x - 0.0044x 为蔗糖标准品质量(μg),y ΔA2、按照蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷(V1×Cpr) ÷T =471.7×(ΔA+0.0044) ÷Cpr 3、按照样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷(W×V1÷V) ÷T =471.7×(ΔA+0.0044)÷W 4、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷V1÷T=471.7×(ΔA+0.0044) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.02 mLT---反应时间,20 minW---样本质量,gCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照:20μL 标准品+40μL 蒸馏水+10μL 试剂二+200μL 试剂三+60μL 试剂四,依次 加样操作,95℃水浴 20min,冷却后,取 200μL 96 孔板中,480nm 下测定,根 据结果即可制作标准曲线。

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