UDPG焦磷酸化酶试剂盒,微板法

UDPG焦磷酸化酶试剂盒,微板法

UDPG焦磷酸化酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）试 剂盒说明书 （货号：WS5350W 微板法 96 样） 一、产品简介： UDPG 焦磷酸化酶（UGP，EC 2.7.7.9）是碳水化合物代谢的重要指标之一，广泛 分布于自然界中，在微生物及动植物的许多组织中都有存在。催化葡萄糖活化，将 1- 磷酸葡萄糖与 UTP 分子合成为 UDP-葡萄糖（UDPG）。为各类碳水化合物包括蔗糖、 葡聚糖、纤维素、半纤维素、果胶质、糖蛋白等的合成提供葡萄糖基。 UGP 可逆催化反应生成 1 磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 作用下将 NADP 转化为 NADPH，340nm 的吸光值增加速率反映了 UGP 活性。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体15mL×1瓶 4℃保存 试剂二 粉体×1支 -20℃保存 临用前加1.1mL试剂一溶解， 仍-20℃保存。 试剂三 粉体mg×1瓶 4℃保存 临用前加 5.4mL 去离子水溶解。 试剂四 粉体mg×1瓶 4℃保存 临用前加 5.4mL 去离子水溶解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、低温离心机、研钵、蒸馏水。 四、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.2g），加 1mL 提取液，进行冰浴匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细胞样本： 取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破碎细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例进行 提取 ③ 液体样品：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，设定温度为 30℃。 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 80 试剂二 10本试剂盒仅供科研使用 2 【注】1. 若ΔA 差值在零附近徘徊，可以延长反应时间 20min 后读取 A2，则相应的 反应时间 T 则代入计算公式重新计算； 或者加大样本上样量（如：由 10μL 增加到 20μL，则试剂一相应减少，保持 总体积 200μL 不变），改变后的加样体积即 V1 代入计算公式重新计算； 或者由 0.1g 样本取样量增加到 0.2g，加 1mL 的提取液研磨提取。 2. 若上升趋势不稳定，可以每隔 10S 读取一次吸光值，选取一段线性 上升的时间段来参与计算，相对应的 A1 和 A2 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 UGP（nmol/min/mg prot）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（V1×Cpr）÷T =1607.8×△A÷Cpr （2）按照样本质量计算 酶活定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 UGP（nmol/min /g 鲜重）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（W ×V1÷V）÷T =1607.8×△A÷W （3）按照细胞数量计算 酶活定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 UGP（nmol/min /104 cell）= [△A÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V) ÷T =3.2×△A （4）按照液体体积计算 酶活定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 UGP（nmol/min /mL）=[△A÷（ε×d）×V2×109]÷V1÷T=1607.8×△A ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； T---反应时间，4min； 500---细胞总数，500 万； W---样本质量，g ； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 试剂三 50 轻轻混匀，30℃孵育 10min。 试剂四 50 轻轻混匀，反应开始，1min 时在 340nm 处读取吸光值 A1， 5min 时读取 A2，△A=A2-A1。