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细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒

更新时间:2024-05-22

简要描述:

细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒
蔗糖酶即蔗糖转化酶(Invertase,E.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。

细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒

细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒说明书 (货号:WS8150F 分光法 24 样) 一、产品简介: 蔗糖酶即蔗糖转化酶(InvertaseE.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等 植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 PH 值,蔗糖转化酶分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两 种类型,许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。 AI 的最适 pH 3.05.0AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AIB-AIcell-wall binding acid invertase)两种类型,前者分布在液泡中或细胞自由空间,后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。B-AI 主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维持库源之间蔗糖的浓度。 B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,经光谱 扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 A 液体 30mL×1 4℃保存 提取液 B 液体 30mL×1 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂×1 4℃保存 临用前加入 7.5mL 试剂一充分溶 解备用;用不完的试剂 4保存; 试剂三 液体 13mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、移液器、研钵、 冰和蒸馏水。 四、细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 按照组织质量(g):提取液 A 体积(mL)15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液 A),进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min,弃上清,留沉淀。 ② 沉淀中加入 1mL 蒸馏水,震荡混匀,12000rpm4℃离心 10min,弃上清,留沉淀。 ③ 沉淀中加入 1mL 提取液 B 充分混匀,4℃浸提过夜,12000 rpm 4℃离心 20min,取 上清置冰上待测。 2、上机检测1 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 100 100 试剂一 250 500 试剂二 250 混匀, 37℃准确水浴 20min 后,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧, 以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变) 试剂三 250 250本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),流水冷 却后充分混匀,全部上清液转移至 1mL 玻璃比色皿中,540nm 处读 取吸光值 AΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:1.若吸光值大于 1.5,可以用蒸馏水稀释样本后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数 D2.ΔA 值在零附近徘徊,可增加样本加样体积 V1(如增至 200μL,则试剂一相应减少),或 延长 37℃水浴时间(如增至 40min 或更长),则相应的 V1 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y = 0.0035x - 0.0038x 为标准品质量(μg),y ΔA2、按蛋白浓度计算: 单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0038)÷0.0035]÷(V1×Cpr )÷T×D =142.9×(ΔA+0.0038)÷Cpr×D 3、按鲜重计算: 单位定义:37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI) (μg/min/g 鲜重)=[ΔA+0.0038)÷0.0035]÷(W×V1÷V)÷T×D =142.9×(ΔA +0.0038)÷W×D V---加入提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.1mLT---反应时间,20minW---样本鲜重,gD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照:100μL 标准品+500μL 试剂一+250μL 试剂三,依次加样操作,95℃水浴 10min冷却后,全部上清液转移至 1mL 玻璃比色皿中,540nm 下测定,根据结果即可制作 标准曲线。


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