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α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-21

简要描述:

α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)是一种水解酶,可以水解人们日常饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业上具有许多潜在的应用价值。

α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS0850W 微板法 48 样) 一、产品简介: α-L-鼠李糖苷酶α-L-rhamnosidaseEC 3.2.1.40)是一种水解酶,可以水解人们日常 饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业 上具有许多潜在的应用价值。 本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作为底物,生成黄色的对硝基苯fen(PNP), 该产物在 405nm 处有最大吸收峰。通过检测 PNP 405nm 下的增加速率,即可得到α-L- 鼠李糖苷酶活性的大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下或离心使试剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶 解混匀,若难溶解可超声溶解。 试剂二 液体 10mL×1 4℃保存 试剂三 液体 10mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。 四、α-L-鼠李糖苷酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,4×12000rpm 离心 15min,取上清液待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:可直接测定,或者适当稀释后测定。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30 min,调节波长为 405nm② 所有试剂于 40℃水浴中预热 20 min③ 在 96 孔板中依次加入下列试剂: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 20 试剂二 70 90 迅速混匀,40℃保温 20min本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 100 100 混匀,5min 立即405nm 下读取吸光值 AΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:A 的值非常低在零附近,可增加样本量 V1(如增至 20μL,则试剂二相应减少)或 延长反应时间 T(如增至 30min 或更长),则重新调整的 V1 T 须代入公式重新计算。 A 的值超过 1,则需要稀释样本,稀释倍数 D 代入计算公式; 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 53.937x - 0.0037x 是标准品(PNP)摩尔质量:μmoly 是△A2按照样本质量计算: 酶活定义:在 40℃下,每克组织每小时水解 1μmoLPNPR 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0037)÷53.937]÷(W×V1÷V)÷T×D =5.56×(A +0.0037)÷W×D 3按照样本蛋白浓度计算: 酶活定义:在 40℃下,每毫克蛋白每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0037)÷53.937]÷(Cpr×V1)÷T×D =5.56×(A +0.0037)÷Cpr×D 4、按细胞数量计算: 酶活定义:在 40℃下,每 104个细胞每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/104 cell)=[(A+0.0037)÷53.937]÷(500×V1)÷T×D =0.011×(A +0.0037)×D 5、按液体体积计算: 酶活定义:在 40℃下,每毫升液体每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)= [(A+0.0037)÷53.937]÷V1÷T×D =5.56×(A +0.0037) W---样品质量,gV---提取液体积,1 mLV1---上清液体积(mL),0.01mLT---反应时间,20 min=1/3hD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---上清液蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol /ml):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水溶解,若有结晶析出,需 37℃ 水浴至wan全溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3 依据 10ul 的标准品+90ul 的试剂二,再加 100ul 的试剂三,于 405nm 处读值;根据结果即可制作 标准曲线。

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