α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

α-L-鼠李糖苷酶测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)活性测定试剂盒说明书 （货号:WS0850W 微板法 48 样） 一、产品简介： α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是一种水解酶，可以水解人们日常 饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业 上具有许多潜在的应用价值。 本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作为底物，生成黄色的对硝基苯fen（PNP）， 该产物在 405nm 处有最大吸收峰。通过检测 PNP 在 405nm 下的增加速率，即可得到α-L- 鼠李糖苷酶活性的大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下或离心使试剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶 解混匀，若难溶解可超声溶解。 试剂二 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。 四、α-L-鼠李糖苷酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，4℃×12000rpm 离心 15min，取上清液待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长为 405nm。 ② 所有试剂于 40℃水浴中预热 20 min。 ③ 在 96 孔板中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 20 试剂二 70 90 迅速混匀，40℃保温 20min本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 100 100 混匀，5min 后立即于 405nm 下读取吸光值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：①若△A 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1（如增至 20μL，则试剂二相应减少）或 延长反应时间 T（如增至 30min 或更长），则重新调整的 V1 和 T 须代入公式重新计算。 ②若△A 的值超过 1，则需要稀释样本，稀释倍数 D 代入计算公式； 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 53.937x - 0.0037，x 是标准品（PNP）摩尔质量：μmol；y 是△A。 2、按照样本质量计算： 酶活定义：在 40℃下，每克组织每小时水解 1μmoLPNPR 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(W×V1÷V)÷T×D =5.56×(△A +0.0037)÷W×D 3、按照样本蛋白浓度计算： 酶活定义：在 40℃下，每毫克蛋白每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(Cpr×V1)÷T×D =5.56×(△A +0.0037)÷Cpr×D 4、按细胞数量计算： 酶活定义：在 40℃下，每 104个细胞每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(500×V1)÷T×D =0.011×(△A +0.0037)×D 5、按液体体积计算： 酶活定义：在 40℃下，每毫升液体每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)= [(△A+0.0037)÷53.937]÷V1÷T×D =5.56×(△A +0.0037) W---样品质量，g； V---提取液体积，1 mL； V1---上清液体积（mL），0.01mL； T---反应时间，20 min=1/3h。 D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol /ml）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水溶解，若有结晶析出，需 37℃ 水浴至wan全溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3 依据 10ul 的标准品+90ul 的试剂二，再加 100ul 的试剂三，于 405nm 处读值；根据结果即可制作 标准曲线。