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N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒

更新时间:2024-05-21

简要描述:

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG,EC 3.2.1.52)是溶酶体中的一种酸性水解酶,广泛存在于各种组织、体液和细胞中,该酶活性变化与机体某些病理状态密切相关。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)试剂盒说明书 (货号:WS2350F 分光法 24 样) 一、产品简介: N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGEC 3.2.1.52)是溶酶体中的一种酸性水解酶,广 泛存在于各种组织、体液和细胞中,该酶活性变化与机体某些病理状态密切相关。 NAG 分解 4-硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖生成对-硝基*酚(PNP),在 415nm 处检测 该产物的升高速率,来计算 NAG 活力大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 2.1mL 蒸馏水,充分溶解备用,用 不完的试剂仍-20℃保存; 试剂二 液体 6mL×1 4℃保存 试剂三 液体 35mL×1 4℃保存 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅或恒温培养箱、 可调式移液器。 四、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本的制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴 匀浆。15000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本,按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 提取。 ② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000 rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】若增加样本,可以按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 415nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 80 蒸馏水 80 试剂二 100 100 迅速混匀,37℃保温 30min 试剂三 600 600本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,取全部上清液于 1mL 玻璃比色皿中,415nm 处测定吸光值 AΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:1.ΔA 在零附近徘徊,可延长 37孵育时间 T(如增至 1 小时或更长),或增加加样体积 V1 (如增至 50μL,则试剂二相应减少)或增加取样质量 W(如增至 0.2g)。则改变后的 T V1 W 需代入公式重新计算。 2.A 测定大于 1.5 A 大于 1.5,可缩短 37孵育时间 T(如减至 10min 或更短)或减少 加样体积 V1(如减至 10μL,则试剂二相应增加)。则改变后 T V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0187x + 0.0095x 为标准品质量(nmol),y 为吸光值ΔA 2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(V1×Cpr)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(W×V1÷V)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义一个酶活单位。 NAG 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(500×V1÷V)÷T=0.18×(ΔA-0.0095) 5、按液体体积计算: 单位定义:每毫升样本每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷V1÷T=89.1×(ΔA-0.0095) V----加入提取液体积,1mLV1----加入反应体系中样本体积,20μL=0.02mLW----样本质量,g500----细胞或细菌总数,500 万; T----反应时间,30minPNP 对分子质量----139.11Cpr----样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 EP 管加入:20μL 标准品+180μL 试剂二+600μL 试剂三,混匀,取 200μL 96 孔板中,于 415nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。

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