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β-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-20

简要描述:

β-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法
β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25, β-Man)属于外切水解酶类,又称 β-D-露糖苷甘露糖水 解酶、外切-β-D-甘露聚糖酶

β-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法

β-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 β-甘露糖苷酶(β-Mannosidase,β-Man)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS1270W 微板法 48 样) 一、产品简介 : β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25, β-Man)属于外切水解酶类,又称 β-D-露糖苷甘露糖水 解酶、外切-β-D-甘露聚糖酶,它能够催化结合甘露寡聚糖末端非还原性的 β-14-D-苷键,并切下一个甘露糖分子,是甘露聚糖*全降解所必需的水解酶。 β-甘露糖苷酶(β-Man)催化对硝基*酚-β-D-吡喃甘露糖苷产生对硝基*酚(PNP), 该产物在 405nm 处有特征吸收峰,通过测定 405nm 光吸收增加速率,即可计算β-甘露 糖苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 10mL×1 4℃保存 试剂三 液体 10mL×1 4℃保存 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、低温离心机、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、β-甘露糖苷酶(β-Man)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本的制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰 浴匀浆。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 比例提取。 ② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104):提取液体积(mL)500~10001 的比例提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min,调节波长至 405nm② 所有试剂解冻至室温(25℃)在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 20 试剂二 70 90 迅速混匀,37℃保温 30min 试剂三 100 100 混匀,5min 后立即于 405nm 下读取吸光值 AΔA=A本试剂盒仅供科研使用 2 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:1. ΔA 在零附近,可增加样本加样体积 V1(即加样量增加至 40μL,则试剂二相应减 少),或延长保温时间 T(如:由 30min 延长至 60min 或更长),重新调整的 V1 T 需代入计算公式重新计算。 2. A 测定值大于 1.5,可对样本上清液用蒸馏水稀释,则稀释倍数 D 代入公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0427x + 0.003x 为标准品摩尔质量(nmol),y ΔA2、按蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1×Cpr)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷ Cpr×D 3、按样本质量计算: 酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1÷V×W)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷W×D 4、按细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一酶活单位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1÷V×细胞数量)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷细胞数量×D 5、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷V1÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)×D V---加入提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,10μL=0.01mLW---样本质量,g500---细胞或细菌总数,500 万; T---反应时间,30minD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 96 孔板中依次加入:10μL 标准品+90μL 试剂二+100μL 试剂三,混匀于 405nm 读取吸光值,根据结果制作标准曲线。

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