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叶绿体3磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒

更新时间:2024-06-17

简要描述:

叶绿体3磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒
3-磷酸甘油醛脱氢酶分为胞质型和质体型,植物叶绿体中的 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (EC 1.2.1.13)属于是质体型,多以 NADPH 为辅酶,催化糖酵解的逆反应

叶绿体3磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒

叶绿体3磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 叶绿体 3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)试剂盒说明书 (货号:WS8060F 分光法 48 样) 一、产品简介: 3-磷酸甘油醛脱氢酶分为胞质型和质体型,植物叶绿体中的 3-磷酸甘油醛脱氢酶 EC 1.2.1.13)属于是质体型,多以 NADPH 为辅酶,催化糖酵解的逆反应,将 1,3 二磷酸甘油酸还原为 3 磷酸甘油醛,该酶在同化 CO2 的卡尔文循环中起中心作用。 利用 GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADPH 生成 3 磷酸甘油醛和 NADP,于 340nm 处测定 NADPH 的下降速率即可得出叶绿体中 NADPH-GAPDH 酶活性的高低。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 50mL×1 4℃保存 提取液二 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×3 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,每支加 0.4mL 不完的试剂分装后 蒸馏水溶解,用 -20℃保存,禁止 反复冻融,三天内用完。 试剂三 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 30mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、天平、震荡仪、低 温离心机、研钵。 四、叶绿体 3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实 验样本和试剂浪费! 1、样本制备: 组织样本: 称取约0.2g样本,加入1mL提取液一,快速冰浴匀浆后于4℃1600rpm离心5min,弃沉 淀,取上清再4℃5000rpm离心15min弃上清留沉淀,向沉淀中加1mL提取液二,强力 涡旋震荡15s,置于冰上(或冰箱)孵育15min,在4℃13000rpm离心5min,取上清测定叶 绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)的酶活性。提示:整个叶绿体的提取过程须 保持4℃低温环境。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 液体样品:澄清的液体样本直接检测;若浑浊则离心后取上清液检测。 2上机检测: ① 紫外分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,设定温度 25℃,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃)。 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 60 试剂一 20 试剂二 20 试剂三 20 试剂四 580 混匀,室温(25℃)条件下,孵育 10min 试剂五 20 轻轻混匀,室温(25℃)条件下,30s 时于 340nm 处读取吸光值 A110min 后再读取 A2ΔA=A1-A2【注】1.A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 20min 后读取 A2,改变后的反应时间 需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(100μL,则试剂四相应减少),则改变 后的加样体积需代入计算公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定,可以每隔 20S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与 计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会 偏高),可以适当减少样本加样量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 12000rpm, 4℃离心 10min,上清液用于 检测; 4. ΔA 的值大于 0.5,则需减少反应时间(如减少至 5min),或减少样本量(如 40μL), 则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=193×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算 酶活定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=193×ΔA÷W 3、按照液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=193×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd---比色皿光径,1cmV---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.06mLV2---反应体系总体积,0.72mL=7.2×10-4LT---反应时间,10minW---样本质量,g Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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