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糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-14

简要描述:

糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法
糖原合酶(GCS,EC 2.4.1.11)将 UDP-G 糖基加到葡萄糖残基上,以α-1,4-糖苷键相 连延长糖链,GCS 是糖原合成的限速酶

糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法

糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 糖原合酶(Glycogen synthaseGCS)试剂盒说明书 (货号:WS2650W 微板法 96 一、产品简介: 糖原合酶(GCSEC 2.4.1.11)将 UDP-G 糖基加到葡萄糖残基上,以α-14-糖苷键相 连延长糖链,GCS 是糖原合成的限速酶,对糖代谢和血糖稳态的维持具有重要作用。 GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的逐一作用 下,使NADH氧化为NAD+,通过检测NADH340nm处的下降量来计算GCS酶活大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×4 -20℃保存 每支用前甩几下使试剂落入底部, 再加 0.3mL 的蒸馏水溶解备用。用 不完的试剂分装后-20保存,禁止 反复冻融,三天内用完。 试剂三 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体 15mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、糖原合酶(GCS)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 细胞样本: 先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破 碎细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,设置温度 30,调节波长至 340nm试剂放在 30℃水浴 5min96 孔板中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 140 混匀,30℃下孵育 5min试剂五 10 混匀,30℃下,2min 时于 340nm 处读取吸光 A122min 时读取 A2,△A=A1-A2【注】1.ΔA 过小,可以延长反应时间(如:32min 或更长)再读取 A2,或增加样本加样量 V1(如 增至 40μL,则试剂四相应减小),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 2.A2 值小于 0.45,则需缩短反应时间 T(如减至 12min)再读取 A2 或减少样本量 V1(如减 10μL,则试剂四相应增加),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCSnmol/min/mg prot)=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCSnmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按细胞密度计算 单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCSnmol/min/104 cell)=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.323×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmd---96 孔板光径,0.5cmV---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.02mLV2---反应体系总体积,2×10-4 LT---反应时间,20 minW---样本质量,g500---细胞数量; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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