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海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-13

简要描述:

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法
6-磷酸海藻糖酯酶(trehalose-6-phosphatephophatase,TPP,EC3.1.3.12)是海藻糖合 成的关键酶之一,催化海藻糖-6磷酸生成海藻糖。

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 6-磷酸海藻糖酯酶(TPP)试剂盒说明书 (货号:WS2850W 微板法 48 样) 一、产品简介: 6-磷酸海藻糖酯酶(trehalose-6-phosphatephophataseTPPEC3.1.3.12)是海藻糖合 成的关键酶之一,催化海藻糖-6磷酸生成海藻糖。 本试剂盒利用 6-磷酸海藻糖酯酶催化底物 6-磷酸海藻糖生成海藻糖,海藻糖在海藻 糖酶的作用下分解成葡萄糖,接着在葡萄糖氧化酶作用下与特异显色剂反应生成有色物 质,通过检测该有色物质在 520nm 处的值,即可得出的 6-磷酸海藻糖酯酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 8mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂 分装后-20℃保存,尽量不要反复冻融。 试剂三 液体 1mL ×1 -20℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 液体 15mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱/金属浴、可调式移液器、研钵、冰。 四、6-磷酸海藻糖酯酶(TPP)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实 验样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织样本(水分足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,冰 浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌或真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取 液;冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),室温晃动提取 30min8000rpm 室温(25℃)离心 10min,取上清。 【注】:若增加样本量,可按照提取液体积(mL) :细菌或真菌数量(104个)为 1500~1000 的比例提取 ③ 液体样本:澄清的液体样本,可直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 520nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 60 80 试剂二 20 混匀,37℃孵育 30min 后,立即沸水浴或金属本试剂盒仅供科研使用 2 5min 拿出。冷却至室温后再继续添加试剂。 试剂三 10 10 混匀,37℃孵育 15min。室温下于 12000rpm 10min,上清液待检测。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 上步待测液 40 40 试剂四 10 10 试剂五 150 150 混匀,37℃避光孵育 20min520nm 下读取吸光值 AA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)【注】1.A 测定大于 1.5,可对步的上清液用蒸馏水稀释,则稀释倍数 D 代入公式计算。 2.A 差值在零附近,可增加步中样本的体积 V1(如增至 40μL,则试剂一相应减少), 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y =0.1166x - 0.007x 为标准品质量(μg),y A2、按照蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白在每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(V1×Cpr)÷T=2358.5×(ΔA+0.007) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(W×V1÷V)÷T=2358.5×(ΔA+0.007)÷W 4、按细菌或真菌密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或真菌每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/104cell)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(500×V1÷V)÷T=4.72×(ΔA+0.007) 5、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/mL)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷V1÷T=2358.5×(ΔA+0.007) V--提取液体积,1 mLV1--样本体积:0.02mLW--样本质量,gT--反应时间,0.5 小时; 500--细菌或真菌数量,500 万;0.11--第②歩反应的总体积;0.04--第③歩反应上清液体积; Cpr--样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中,再加 2mL 蒸馏水混匀 溶解即 1mg/mL 的葡萄糖(母液需在两天内用且-20℃保存)。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度:0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL3 第③歩显色反应阶段检测:40μL 标准品+10μL 试剂四+150μL 试剂五,37℃避光孵育 20min520nm 下读取吸光值 A。依据结果制作标准曲线。

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