谷丙/丙an酸氨基转氨酶(GPT/ALT)试剂盒

谷丙/丙an酸氨基转氨酶(GPT/ALT)试剂盒

谷丙/丙an酸氨基转氨酶(GPT/ALT)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 谷丙转氨酶/丙*酸氨基转氨酶(GPT/ALT)试剂盒说明书 （货号：WS3240F 分光法 48 样） 一、产品简介： 丙*酸氨基转氨酶，旧称谷丙转氨酶，缩写为 ALT 或 GPT（EC 2.6.1.2）广泛存在于 动植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和酮酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要 作用。 谷丙转氨酶/丙*酸氨基转氨酶(GPT/ALT)催化丙*酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应， 生成丙酮酸和谷*酸；加入 2,4-二硝基*肼溶液，不仅终止上述反应，而且与丙酮酸反应 形成丙酮酸二硝基*腙，在碱性溶液中显棕红色。通过在 520nm 读取吸光值并计算出该 酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 支 4℃保存 试剂二 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、 可调式移液器、研钵。 四、谷丙转氨酶/丙*酸氨基转氨酶(GPT/ALT)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 2 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例提取。 ③ 血清（浆）样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机测定： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。 ② 可先做 2 个样本预测定，熟悉操作过程，并依据测出的吸光值 A 是否超出标准曲线的 线性范围来做调整。 3 在 1.5mLEP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂一 10 10 试剂二 60 60 混匀，于 37℃孵育 30min 试剂三 60 60 样本 20 混匀，于 37℃孵育 10min 试剂四 600 600 混匀，25℃孵育 10min，全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿 中，于 520nm 处测定吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 【注】1.若 A 测定超过 1.5，可降低样本量 V1（如 10μL），试剂一相应增加。则改变后的加样 体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若△A 的值在零附近徘徊，则可增加样本量 V1（如 30μL，则试剂一相应减少），或增加 样本取样质量（W），则改变后的加样体积 V1 和取样质量 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0232x + 0.0022，x 为标准品摩尔质量（nmol）；y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GPT/ALT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(V1×Cpr)÷T=71.8×(ΔA-0.0022)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GPT/ALT(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(W×V1÷V)÷T=71.8×(ΔA-0.0022)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GPT/ALT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(500×V1÷V)÷T=0.144×(ΔA-0.0022) 5、血清（浆）活力计算: 酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GPT/ALT(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232] ÷V1÷T=71.8×(ΔA-0.0022) V---提取液体积，1 mL； V1---反应体系中样本体积，0.02mL； T---反应时间，30 min； W---样本质量，g；500---细胞或细菌总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL ；建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（20μmol/mL）：加 1mL 蒸馏水溶解标准品，充分混匀。 2 把母液稀释成以下浓度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。 3 30μL 标准品+60μL 试剂二+60μL 试剂三，混匀，于 37℃孵育 10min ；再加 600μL 试剂四，混匀，25℃孵育 10min，于 520nm 处测定吸光值 A，依据结果即可制作标 准曲线。