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外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

更新时间:2024-06-06

简要描述:

外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法
土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶又称土壤纤维二糖水解酶(CBH,EC 3.2.1.91)是土壤纤维素 酶系的组份之一

外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶(S-CBH)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS3230W 微板法 96 ) 一、产品简介: 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶又称土壤纤维二糖水解酶(CBHEC 3.2.1.91)是土壤纤维素 酶系的组份之一,该酶作用于β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖(还原糖)分子,本 试剂盒采用该酶催化对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷生成黄色物质对-硝基*酚(PNP),该物 质在 405nm 有特征光吸收,进而得到土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶(S-CBH)活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 120mL×1 液体 60mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×4 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部, 每支再加入 1.4mL 蒸馏水溶解, 4 度保存。 试剂三 液体 40mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅或恒温振荡培养箱、可调式移液器、蒸馏水。 四、土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 取新鲜土样或干土(风干或者 37 度烘箱风干),先粗研磨,过 40 目筛网备用。 【注】:土壤风干,减少土壤中水分对于实验的干扰;土壤过筛,保证取样的均匀细腻; 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 405nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 空白管(仅做一次) 土样(g0.1 0.1 试剂一 750 800 750 试剂二 50 50 充分混匀,37℃培养 2 小时(振荡培养或间隔 20min 手动振荡 混匀几下) 试剂三 200 200 200 混匀,8000rpm 离心 5min(若上清液不澄清可加大离心力),取 200μL 上清液至 96 孔板中,405nm 下读取吸光值 AA=A - A 对照-A 空白(每个样本做一个自身对照)。 【注】:1.ΔA 较小,可延长 37℃的孵育时间 T(如增至 4 小时或更长),或增加土样质 W(如增至 0.3g)。则改变后的 T W 需代入计算公式重新计算。 2.若测定管 A 值大于 1.5 A 大于 1.5,可缩短 37℃的孵育时间 T(如减至 0.5 小时或更短), 或减少土样质量 W(如减至 0.05g)。则改变后 T W 需代入计算公式重新计算。或对最本试剂盒仅供科研使用 2 后一步的待检测上清液(包括测定管、对照管和空白管)同时用蒸馏水进行稀释,稀释倍 D 代入计算公式。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0108x + 0.0053x 为标准品摩尔质量(nmol),y A2、单位定义:每小时每克土样中产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活单位。 S-CBH 活力(nmol/h/g 土样)=(ΔA-0.0053) ÷0.0108÷W÷T×D =46.3×(ΔA-0.0053)÷W×D T---反应时间,2hW---土壤样本实际取样量,gPNP 相对分子质量---139.11D---稀释倍数,未稀释即为 1附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):向标准品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸馏水超声溶解。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3 EP 管加入:50μL 标准品+750μL 试剂一+200μL 试剂三,混匀,取 200μL 96 孔板中,于 405nm 下读取吸光值,根据结果制作标准曲线。

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