硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS2040W 微板法 96 样） 一、产品简介： 硝酸还原酶（NR，EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是一种诱导酶。是植物硝态氮转 化为氨态氮的关键酶，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，是植物营养或农田施肥的 指标之一，也可作为品种选育的指标之一。 本试剂盒采用离体法检测，通过硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐进 一步与磺胺及α-萘胺定量生成紫红色偶氮化合物；颜色深浅与硝酸还原酶活性呈正比， 通过检测该物质于 530nm 的吸光值，即可得出硝酸还原酶的活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入试管底部，再加 10mL 提取液溶解，仍 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每支分别 加 1mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融，三天内用完。 试剂三 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，每瓶再加 6mL 蒸 馏水，于 70℃水浴约半小时至*全溶解备用。 试剂四 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 使用前需超声至*全溶解。 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、研钵、冰和蒸馏水。 四、硝酸还原酶（NR）活性测定： 由于硝酸还原酶是个诱导酶，酶活性大小与取样前是否诱导有关（施过氮肥、光照充足 条件下所取植物样本即为诱导处理样本），因此务必取 2 个样本做预测定，依据预测定结果选 择是否进行诱导处理。 酶的诱导（选做）：取适量新鲜样本洗净，放入盛有 1mg/mL 硝酸钾溶液（自备）的 烧杯中（淹没即可），浸泡 2h，取出样本用滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min，取出样本再 用滤纸吸干后即可按照样本制备步骤制备待测上清液。 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆(难磨样本可用石英砂 研磨，不能用液氮研磨)。12000rpm，4℃离心 10min，取上清液，置冰上待测。 【注意】提取过程操作应迅速，并且在 4℃下进行。若样本颜色较深（如植物叶片），可在样本制备过 程中增加除色素步骤：取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 的 80%乙醇冰浴匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 530nm。 ② 反应 mix 的制备：已*全溶解的试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合（每次可根据本试剂盒仅供科研使用 2 检测样本数量现用现配），试剂三和四*全溶解后于 4℃存放一段时间会有沉淀析 出，每次配置反应 mix 前需重新*全溶解。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 70 试剂二 30 蒸馏水 100 30℃（如水浴锅或恒温培养箱）避光培养 30min 反应 mix 100 100 混匀，30℃避光反应 15min，立即于 530nm 处读取吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本需做一个自身对照）。 【注】：1.若△A 值低于 0.005，可增加样本加样体积 V1（如增至 50μL，则试剂一相应减少）， 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 2. 若整个反应结束后有沉淀浑浊现象，可在 EP 管中重新按照上表加入相应试剂量，加完反 应 mix 于 30℃避光反应 15min 后，室温 12000rpm 离心 3min，取等体积的上清液至 96 孔板中读值。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.7244x-0.0002；x 为标准品摩尔浓度（μmol/mL），y 为△A。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每小时每克鲜重样品中催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T=2761×(△A+0.0002)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每小时每毫克组织蛋白催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T=2761×(△A+0.0002)÷Cpr 4、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每小时每百万细菌或细胞催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/104 cell)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T=5.52×(△A+0.0002) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积：0.02mL； T---反应时间，30min=0.5h； W---样本鲜重，g； 500---细胞数量，百万； 标准品亚*酸钠的分子量---69； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液：用 1mL 的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释 200 倍即为 0.5μmol/mL，现配现用。（母 液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3 按照测定管的加样步骤操作，根据结果即可制作标准曲线。