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硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

更新时间:2024-06-03

简要描述:

硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法
硝酸还原酶(NR,EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是一种诱导酶。是植物硝态氮转 化为氨态氮的关键酶,与作物有效吸收和利用氮素肥料有关,是植物营养或农田施肥的 指标之一,也可作为品种选育的指标之一。

硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

硝酸还原酶(NR)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 硝酸还原酶(Nitrate ReductaseNR)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS2040W 微板法 96 样) 一、产品简介: 硝酸还原酶(NREC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是一种诱导酶。是植物硝态氮转 化为氨态氮的关键酶,与作物有效吸收和利用氮素肥料有关,是植物营养或农田施肥的 指标之一,也可作为品种选育的指标之一。 本试剂盒采用离体法检测,通过硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐进 一步与磺胺及α-萘胺定量生成紫红色偶氮化合物;颜色深浅与硝酸还原酶活性呈正比, 通过检测该物质于 530nm 的吸光值,即可得出硝酸还原酶的活性。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下使试剂落入试管底部,再加 10mL 提取液溶解,仍 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×4 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分别 1mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂分装后-20℃ 保存,禁止反复冻融,三天内用完。 试剂三 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,每瓶再加 6mL 馏水,于 70℃水浴约半小时至*全溶解备用。 试剂四 液体 10mL×1 4℃保存 使用前需超声至*全溶解。 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、研钵、冰和蒸馏水。 四、硝酸还原酶(NR)活性测定: 由于硝酸还原酶是个诱导酶,酶活性大小与取样前是否诱导有关(施过氮肥、光照充足 条件下所取植物样本即为诱导处理样本),因此务必取 2 个样本做预测定,依据预测定结果选 择是否进行诱导处理。 酶的诱导(选做):取适量新鲜样本洗净,放入盛有 1mg/mL 硝酸钾溶液(自备)的 烧杯中(淹没即可),浸泡 2h,取出样本用滤纸吸干后,-20℃冷冻 30min,取出样本再 用滤纸吸干后即可按照样本制备步骤制备待测上清液。 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆(难磨样本可用石英砂 研磨,不能用液氮研磨)12000rpm4℃离心 10min,取上清液,置冰上待测。 【注意】提取过程操作应迅速,并且在 4℃下进行。若样本颜色较深(如植物叶片),可在样本制备过 程中增加除色素步骤:取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 80%乙醇冰浴匀浆, 12000rpm4℃离心 10min,弃掉色素较深的上清液;以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液,混匀或再次冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,300W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 530nm② 反应 mix 的制备:已*全溶解的试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合(每次可根据本试剂盒仅供科研使用 2 检测样本数量现用现配),试剂三和四*全溶解后于 4℃存放一段时间会有沉淀析 出,每次配置反应 mix 前需重新*全溶解③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 70 试剂二 30 蒸馏水 100 30℃(如水浴锅或恒温培养箱)避光培养 30min 反应 mix 100 100 混匀,30℃避光反应 15min,立即于 530nm 处读取吸光值 AA=A 测定-A 对照(每个样本需做一个自身对照)。 【注】:1.A 值低于 0.005,可增加样本加样体积 V1(如增至 50μL,则试剂一相应减少), 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 2. 若整个反应结束后有沉淀浑浊现象,可在 EP 管中重新按照上表加入相应试剂量,加完反 mix 30℃避光反应 15min 后,室温 12000rpm 离心 3min,取等体积的上清液至 96 孔板中读值。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.7244x-0.0002x 为标准品摩尔浓度(μmol/mL),y A2、按样本鲜重计算: 单位定义:每小时每克鲜重样品中催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T=2761×(A+0.0002)÷W 3、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每小时每毫克组织蛋白催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/mg prot)=[(A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T=2761×(A+0.0002)÷Cpr 4、按细菌或细胞密度计算: 单位定义:每小时每百万细菌或细胞催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。 NR(nmol/h/104 cell)=[(A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T=5.52×(A+0.0002) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积:0.02mLT---反应时间,30min=0.5hW---样本鲜重,g500---细胞数量,百万; 标准品亚*酸钠的分子量---69Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液:用 1mL 的蒸馏水溶解,再用蒸馏水稀释 200 倍即为 0.5μmol/mL,现配现用。(母 液需在两天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3 按照测定管的加样步骤操作,根据结果即可制作标准曲线。

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