尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 尿素（Urea）含量（酶法）检测试剂盒说明书 （货号：WS1021W 微板法 96 样） 一、产品简介： 尿素（Urea）又称碳酰胺，旧称尿素氮（BUN），是哺乳动物和某些鱼类体内蛋白质 代谢分解的主要含氮产物，也是目前含氮量最高的氮肥。 该试剂盒利用尿素在脲酶的作用下水解产生氨离子和二氧化碳，氨离子在碱性介质中 与酚显色剂生成蓝色物质，该物质的生成量与尿素含量成正比。通过于625nm处检测该 有色物质含量进而得出尿素氮含量。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 粉体 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再加 1.1mL 的蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 3mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 试剂三 A×2 支 试剂三 B×1 支 4℃保存 临用前向一支试剂三 A 中加入 46μL 的试剂三 B，混匀备用。 标准管 粉体 mg×2 支 4℃保存 每支临用前加1mL蒸馏水溶解，即浓 度为6mg/mL的尿素，检测前再用蒸馏 水稀释200倍（5:995）即成0.03mg/mL （0.5mmol/L）的尿素。 三、所需仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、天平、移液器、离心机、蒸馏水。 四、尿素（Urea）含量检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 液体样品：液体样品：澄清的液体可直接检测；若浑浊则离心后取上清液检测。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 生 理盐水，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 室温离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，设置温度在 37℃，设定波长到 625nm。 ② 做实验前选取 2 个样本，找出适合本次检测样本的稀释倍数 D（如：尿液样本可用 蒸馏水稀释 100 倍）。 ③ 所有试剂解冻至室温，在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称 （μL） 测定管 空白管 （仅做一次） 标准管 （仅做一次） 样本 20 蒸馏水 20 标准品 20 试剂一 10 10 10 蒸馏水 130 130 130 混匀，37℃避光反应 15min 试剂二 20 20 20 试剂三 20 20 20 混匀，37℃避光反应 20min，于 625nm 处读取吸光值 A， △A=A 测定-A 空白。 【注】：1.测定管的 A 值若超过 1.5，可把样本用生理盐水或蒸馏水进行稀释，稀释倍数 D 代入计 算公式。 2.若△A 的差值在零附近徘徊，可增加样本加样量 V1（如增至 50μL，则蒸馏水相应减少， 保持总体积不变；空白管和标准管维持不变），则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按液体体积计算： 尿素含量(mg/L)=(C 标准×V 标)×103×△A÷(A 标准-A 空白)÷V1×D =30×△A÷(A 标准-A 空白)×D 尿素含量(mmol/L)=(C 标准×V 标)÷60.04×103×△A÷(A 标准-A 空白)÷V1×D =0.5×△A÷(A 标准-A 空白)×D 2、按细胞数量计算： 尿素含量(ng/104 cell)=(C 标准×V 标)×106×△A÷(A 标准-A 空白)÷(500×V1÷V)×D =60×△A÷(A 标准-A 空白)×D 尿素含量(nmol/104 cell)=(C 标准×V 标)÷60.04×106×△A÷(A 标准-A 空白)÷(500×V1÷V)×D =△A÷(A 标准-A 空白)×D C 标准---尿素标品浓度，0.03mg/mL； D---稀释倍数，未稀释即为 1； V1---加入样本体积，0.02mL； V 标---加入标准品体积，0.02mL； V---提取液体积，1mL； 60.04---尿素分子量； 500---细胞数量，万。